張 美 劉 萍① 李吉濤 李 健

(1. 大連海洋大學 大連 116023; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、五須蝦、小白蝦、迎春蝦等,隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亞目(Natantia)、長臂蝦科(Palaemonidae)、長臂蝦屬(Palaemon)、白蝦亞屬(Exopalaemon)(劉瑞玉,1995),產(chǎn)量僅次于中國毛蝦(Acetes chinensis)和中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)。脊尾白蝦具有肉質(zhì)細嫩、繁殖能力強、生長速度快、環(huán)境適應性廣和經(jīng)濟價值高等優(yōu)點,是我國特有的小型經(jīng)濟蝦類之一。近年來,作為沿海灘涂地區(qū)重要的特色水產(chǎn)品,脊尾白蝦繁育和養(yǎng)殖技術日漸成熟。梁俊平等(2012a)研究了脊尾白蝦全人工繁育技術,明確了胚胎發(fā)育、幼體孵化的適宜溫度和鹽度范圍; 栗治國等(2013)對胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育及其主要環(huán)境影響因素也進行了探討。在脊尾白蝦疾病防治方面,許文軍等(2010)對池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦感染血卵渦鞭蟲進行了系統(tǒng)的病原學研究; 沈輝等(2013)研究了白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的致病性。在脊尾白蝦免疫等功能基因方面,段亞飛等(2013)首次構建了血細胞cDNA文庫,克隆了組織蛋白酶L、谷胱甘肽過氧化物酶和組織蛋白酶D等基因,并分析了這些基因在機體免疫應答反應中的作用; 李美玉等(2012)克隆了鐵蛋白基因,并分析了 WSSV攻毒刺激后其在轉(zhuǎn)錄水平的表達變化。而關于環(huán)境脅迫方面的研究也有報道,韓俊英等(2011)克隆得到熱休克蛋白HSP70基因,分析了其在溫度、pH值和氨氮脅迫下的響應; 李洋等(2013,2014)克隆了酚氧化酶原基因和絲氨酸蛋白酶抑制劑基因,分析了鹽度脅迫后其在肝胰腺和血細胞組織中的表達變化規(guī)律; 梁俊平等(2012b)確定了脊尾白蝦的氨氮耐受范圍,任海等(2014)研究了急性氨氮脅迫對脊尾白蝦抗氧化系統(tǒng)酶活力及GPx基因表達的影響。

甲殼動物蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH)屬于高血糖激素家族基因,在甲殼動物的生長、繁殖、蛻皮和滲透壓調(diào)節(jié)等一系列活動中發(fā)揮重要作用。MIH通過調(diào)控蛻皮激素的分泌來抑制蛻皮過程,蛻皮激素控制蛻皮過程的發(fā)生,由此可見蛻皮過程主要是由蛻皮抑制激素和蛻皮激素相互拮抗進行調(diào)控。目前 MIH基因在鷹爪蝦(Trachypenaeus curvirostris)(王在照等,2002)、刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)(Tiuet al,2007)、中國對蝦(王在照等,2003)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Sun,1994)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)(Linet al,1998)、日本囊對蝦(Penaeus japonicus)(Ohiraet al,1997)等蝦類中已見相關報道,且發(fā)現(xiàn)在蛻皮調(diào)控研究中發(fā)揮了重要作用。近年來,隨著脊尾白蝦養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴大及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,由病毒和細菌引發(fā)的蝦類疾病頻繁發(fā)生,嚴重影響了蝦類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展,造成了嚴重的經(jīng)濟損失。甲殼動物有復雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),能快速地啟動調(diào)控因子,直接或間接地應對外部因素的刺激。這些外部因素包括溫度、鹽度、光照周期性、營養(yǎng)和壓力等。Lorenzon等(2000)發(fā)現(xiàn),重金屬Hg、Cd脅迫下巖蝦(Palaemon elegans)體內(nèi)高血糖激素(hyperglycemic hormone,CHH)表達量在2h之內(nèi)出現(xiàn)升高。Sedlmeier(1988)揭示,低鹽度下 CHH能促使淡水螯蝦的滲透壓上升。Santos等(1993)發(fā)現(xiàn),注射葡萄糖后 CHH 和乳酸的水平顯著降低,注射乳酸后 CHH和葡萄糖升高,注射任何氨基酸對蟹血淋巴中的 CHH葡萄糖和乳酸無任何影響。Stentiford等(2001)研究發(fā)現(xiàn),感染血卵渦鞭蟲的挪威海螯蝦(Nephropsnorvegicus)血淋巴中CHH含量上升。Webster(1996)發(fā)現(xiàn)普通黃道蟹(Cancer pagurus)組織缺氧導致CHH表達量明顯增加。而MIH的表達水平與外界環(huán)境脅迫的關系僅有少量報道,Chang等(1990)報道,MIH在美洲海螯蝦(Homarus americanu)中具有顯著的高血糖活性。Lago-Lestón等(2007)研究了溫度和鹽度對凡納濱對蝦幼蝦CHH和MIH表達的影響。目前為止,EcMIH基因表達與pH、氨氮脅迫的關系尚未見報道。

本研究采用同源克隆方法獲得脊尾白蝦 MIH-like基因全長cDNA序列,分析了脊尾白蝦在pH、氨氮、鹽度脅迫后其眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中該基因的表達變化規(guī)律,研究結果對于解釋脊尾白蝦的環(huán)境適應性及其健康養(yǎng)殖具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用蝦 本實驗用健康脊尾白蝦均為同一家系蛻皮間期,2013年9月取自山東昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責任公司,體長(4.10±0.30)cm,體重(1.10±0.30)g。放在200L PVC桶中暫養(yǎng)一周,期間每日換水1/3。投喂消毒處理后的沙蠶。之后進行為期 5天的環(huán)境脅迫實驗,期間不投餌也不換水。

1.1.2 實驗試劑及耗材 TRIzol Reagent、FS Universal SYBR Green Master (ROX)購自Roche公司;LATaq試劑盒、PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、PMD18-T載體均購自 TaKaRa公司;SMARTTMRACE Amplification Kit購自Clontech公司;大腸桿菌 Top10感受態(tài)細胞購自北京天根生化科技有限公司; DNA膠回收試劑盒購自上海生工公司; 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 脊尾白蝦眼柄總RNA提取

取 4尾去眼球及眼球內(nèi)黑色素的健康脊尾白蝦眼柄,只留柄部供總 RNA的提取。提取方法按照羅氏說明書進行。用快速核酸/蛋白分析儀對總RNA進行定性和定量檢測。紫外分光光度計和 1.0%的 TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性。

1.3 脊尾白蝦EcMIH基因cDNA中間片段克隆

參考GenBank公布的中國對蝦(AF312977.4)、羅氏沼蝦(KC990939.1)、凡納濱對蝦(DQ412566.1)日本囊對蝦(AB162448.1)、刀額新對蝦(AB162448.1)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)(AY496454.1)MIH基因的cDNA編碼區(qū),利用DNAMAN軟件根據(jù)保守區(qū)設計一對簡并引物FM1和RM1(表1)。

以脊尾白蝦眼柄cDNA為模板,利用設計好的簡并引物克隆出脊尾白蝦EcMIH基因的中間序列。PCR反應程序: 94°C 5min; 94°C 30s,57°C 30s,72°C 30s,30個循環(huán); 72°C 10min。將PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測序,得到脊尾白蝦 MIH基因中間目的片段206bp。

1.4 脊尾白蝦EcMIH基因全長cDNA的克隆

根據(jù)已獲得脊尾白蝦EcMIH基因cDNA中間序列設計 3'RACE和 5'RACE特異性引物。MspF1、MspF2、MspR1和MspR2,然后再根據(jù)獲得3'RACE和 5'RACE部分序列設計特異性引物 MspF3和MspR3(表 1)。用 SMART?RACE Amplification Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

表1 引物名稱和序列Tab.1 Names and sequences of the primers

以脊尾白蝦眼柄第一鏈cDNA為模板,利用LA Taq (TaKaRa)試劑盒進行3'RACE、5'RACE擴增。第一次擴增反應體系為: 模板cDNA 0.2μL; TaKaRa LA Taq (5U/μL) 0.1μL; 10×LA PCR Buffer 1μL; dNTP mixture (各 2.5mm) 1.6μL; 引物各 0.2μL; 滅菌水6.7μL。第二次擴增反應體系為: 引物各 0.2μL;TaKaRa LA Taq (5U/μL) 0.1μL; 第一次 PCR 產(chǎn)物0.5μL; 10×LA PCR Buffer 1μL; dNTP mixture (各2.5mm) 1.6μL; 滅菌水 6.4μL。3'RACE 第一次擴增用引物 MspF1和通用引物 UPM,第二次擴增用引物MspF2、MspF3和通用引物NUP。5'RACE第一次擴增用引物MspR1和通用引物UPM,第二次擴增用引物 MspR2、MspR3和通用引物 NUP。反應程序為:94°C 4min; 94°C 30s,57°C 30s,72°C 2min,30 個循環(huán);72°C 10min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用 DNA膠回收試劑盒切膠回收目的片段,純化并檢測。膠回收產(chǎn)物與PMD18-T載體相連接。5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50μLE.coliTop10感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆進行菌落 PCR鑒定。鑒定結果送與上海桑尼生物科技有限公司進行測序。

1.5 序列分析

利用NCBI中的 VecScreen去除載體序列,再用BLAST進行序列比對,用 ContigExpress 軟件將 5'端序列、中間片段、3'端序列進行拼接。使用BLAST對獲得的 MIH基因序列以及推導出的氨基酸序列進行同源性比對。然后用EditSeq程序搜尋開放閱讀框(ORF)并將其翻譯成氨基酸。利用 SMART軟件進行功能域預測。用DNAMAN軟件對脊尾白蝦MIH-like基因與其它物種的MIH氨基酸序列進行多序列比對,采用 MAGE4.0軟件中的鄰接法(Neighbour-Joining)構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 脅迫實驗設計

1.6.1 pH 根據(jù)于天基等(2014)報道的脊尾白蝦半致死pH值的測定。設定本實驗的pH值脅迫組3個,pH值分別為6.5(低pH值脅迫組)、8.0(對照組)、9.5(高pH值脅迫組)。脅迫組所用海水使用25%NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)養(yǎng)殖用水的pH值,實驗期間各處理組pH值的變動幅度為±0.1。pH值每4h調(diào)整一次。每組設3個平行,每個平行36尾蝦。實驗期間分別于0、3、6、12、24、48、72、96h,從實驗桶中隨機挑選4尾蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實驗期間海水溫度為18°C,鹽度為32。

1.6.2 鹽度脅迫實驗 根據(jù)劉海(2005)報道的脊尾白蝦在不同鹽度水體中適應性試驗。設計7個鹽度梯度,分別為 4、11、18、25、32、39、46,鹽度 32為自然海水對照組。其它鹽度組用淡水和海鹽調(diào)節(jié),每組設 3個平行,每個平行 36尾蝦。實驗期間分別于0、3、6、12、24、48、72、96h,從實驗桶中隨機挑選4尾蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實驗期間海水溫度為18°C,pH值為7.8±0.2。

1.6.3 氨氮實驗 根據(jù) Chen等(1988)和鐘碩良等(1997)測定的養(yǎng)殖池塘底層海水的氨氮濃度為0—46mg/L和0.01—29.3mg/L,以及梁俊平(2012b)報道的脊尾白蝦成蝦 72h半致死質(zhì)量氨氮濃度(140.28mg/L),設計本實驗的 5個氨氮梯度,分別為0mg/L(對照)、2mg/L(低濃度)、4mg/L(中濃度)、6mg/L(中高濃度)和8mg/L(高濃度),每個梯度設3個平行,每個平行36尾蝦。使用20g/L的氯化銨調(diào)整不同實驗組的氨氮濃度,每個時間點取樣的同時采集水樣,奈氏試劑法(陳佳蓉,1996)測定水體的總氨氮濃度并測定水體的pH值、溫度和鹽度。根據(jù)Bower and Bidwell方程計算水體中NH3的濃度。實驗期間分別于 0、3、6、12、24、48、72、96h,從實驗桶中隨機挑選4尾脊尾白蝦,取其眼柄和腹神經(jīng)節(jié),保存于液氮中。實驗期間海水溫度為18°C,鹽度為32,pH值為7.8±0.2。此外,為了檢測脊尾白蝦EcMIH基因在不同組織中的表達水平,另取 12尾健康脊尾白蝦的眼柄、腹神經(jīng)節(jié)、心臟、血細胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃等組織,用于 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.7 脊尾白蝦EcMIH基因的表達分析

Trizol試劑提取各實驗組脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)等組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,方法按韓俊英等(2011)進行。以 EcMIH基因的 cDNA序列為模板,設計熒光定量引物MspF4和 MspR4(表 1),根據(jù)GenBank中脊尾白蝦的 β-actin基因序列設計一對內(nèi)參引物β-actin-F、β-actin-R(表1),并檢測熒光定量引物及內(nèi)參引物的特異性,結果顯示良好。利用Real-time PCR檢測pH、鹽度、氨氮脅迫后的脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中不同時間點 MIH基因的相對表達量。反應體系和程序參考FS Universal SYBR Green Master (ROX)說明書,采用 10μL 反應體系,包括正反向引物各 0.1μL; 5μL FS Universal SYBR Green Master (ROX); 1.0μL cDNA; 3.8μL DEPC 水。反應程序為: 95°C 10min; 95°C 10s,60°C 34s,40 個循環(huán);95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。實驗中每 4 尾混合作為一個樣品,數(shù)據(jù)為 3個重復的平均值±標準差,采用2-△△CT法計算脊尾白蝦EcMIH基因的相對表達量,用SPSS17.0軟件進行One-Way ANOVA顯著性分析。

2 結果

2.1 脊尾白蝦EcMIH基因cDNA全長的克隆和序列特征分析

采用RACE方法獲得全長為1218bp,包括360bp的開放閱讀框,394bp的 3′端非編碼區(qū)(UTR)以及420bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)的脊尾白蝦EcMIH基因,序列比較分析確定此基因為脊尾白蝦MIH-like基因,3′端非編碼區(qū)沒有典型的多聚腺苷酸加尾信號AATAAA,有明顯的 PolyA尾(GenBank登錄號為KM103727)(圖 1)。

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)EcMIH基因編碼區(qū)序列編碼120個氨基酸,預測的蛋白分子量為13.71kDa,理論等電點pI為8.02。脊尾白蝦MIH由信號肽和成熟肽組成,其N端含有41個氨基酸組成的信號肽。成熟肽由79個氨基酸組成,其中成熟肽序列含 6個非常保守的半胱氨酸殘基分別為Cys7、Cys24、Cys27、Cys40、Cys44和Cys53,第12位及第72位氨基酸殘基分別為Gly和Ile,其中Gly12是CHH家族基因中Ⅱ組的特征位點(Leeet al,1995),Ile72對EcMIH基因的活性有非常重要的作用(Katayamaet al,2003)。

圖1 脊尾白蝦MIH-like基因全長cDNA序列及開放閱讀框推測的氨基酸序列Fig. 1 The full-length MIH-like cDNA sequence and deduced amino acid sequence of E. carinicauda對應的核苷酸序列的氨基酸用單個大寫字母表示。細線方框內(nèi)的atg為起始密碼子,粗下劃線表示信號肽,信號肽和成熟肽之間用豎線(/)劃分,引物序列用箭頭表示。用*表示終止密碼子。第12位及第72位氨基酸殘基Gly和Ile為CHH家族基因中Ⅱ組的特征位點用陰影表示

2.2 脊尾白蝦EcMIH基因同源性分析

圖2 脊尾白蝦MIH-like成熟肽氨基酸序列與其它甲殼動物CHH家族神經(jīng)肽氨基酸序列的比對Fig. 2 Multiple alignments of E. carinicauda MIH-like mature peptide with neuropeptide amino acid sequence alignment of other Crustaceans CHH families各物種MIH序列登錄號為: 羅氏沼蝦(AAL37948.1)、日本沼蝦(AEJ54622.1)、寄居蟹屬(P55846.1)、克氏原螯蝦(P55848.1)、三疣梭子蟹(ABZ04547.1)、擬穴青蟹(AFM35653.1)、中華絨螯蟹(AAQ81640.1)、斑節(jié)對蝦(AAR89517.1)、挪威海螯蝦(AAK58133.2)、美洲海螯蝦(P55320.1)、青蝦(AEJ54623.1)、斑節(jié)對蝦(ABG33898.1)、羅氏沼蝦(AAL40916.1)、云斑厚紋蟹(AAO27806.1)、普通濱蟹(AAG29435.1)、凡納濱對蝦(BAM93361.1)、黃道蟹(P81034.1)、黃道蟹(P81035.1)

利用NCBI中的BLAST對脊尾白蝦EcMIH基因進行同源性比較分析(圖2),發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦EcMIH基因與日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)和羅氏沼蝦的同源性最高,分別為 87%和 86%。脊尾白蝦MIH-like與其它蝦蟹類如寄居蟹屬(Cancer pagurus)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)等的MIH成熟肽同源性分別為58%、51%、49%、46%、47%。與挪威海螯蝦、美洲海螯蝦、斑節(jié)對蝦和青蝦等的性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone,GIH)成熟肽同源性分別為61%、70%、43%、54%,與黃道蟹大顎器抑制激素(mandibular organ inhibiting hormone,MOIH)MOIH1和MOIH2成熟肽同源性為50%,與羅氏沼蝦、云斑厚紋蟹(Pachygrapsus marmoratus)、普通濱蟹(Carcinus maenas)、凡納濱對蝦的 CHH成熟肽同源性較低分別為 46%、44%、31%、36%。MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)進化樹,結果表明(圖 3),脊尾白蝦MIH-like與羅氏沼蝦 MIH和日本沼蝦 MIH聚為一支。MIH、MOIH和GIH聚為一類,CHH單獨聚為一類,這符合高血糖激素家族基因的分類,分為 CHH Ⅰ族和CHHⅡ族(De Kleijnet al,1995)。由圖可見,所有游泳亞目(Natnatai)的 CHH家族基因聚為一類,所有爬行亞目(Peptnatia)CHH家族基因聚為一類,這符合十足目的分類(魏崇德等,1991)。

2.3 脊尾白蝦MIH基因組織表達分析

采用Real-time PCR分析了脊尾白蝦EcMIH基因在不同組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn) EcMIH基因在眼柄(830.79±0.56) 、 腹 神 經(jīng) 節(jié) (297.34±0.47) 、 腸(6.02±0.44)、心臟(65.19±0.34)、胃(2.11±0.43)和卵巢(1.00±0.36)中均有表達。而在肝臟、肌肉、鰓和血中不表達。在眼柄中的表達量最高,在卵巢中的表達量最少(圖 4)。

Real-time PCR檢測pH脅迫后不同時間脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達情況如圖5所示。結果表明: 無論是低pH脅迫組(pH6.5)還是高pH脅迫組(pH9.5),EcMIH基因的表達量在脅迫 3—72h期間都顯著高于對照組(P＜0.05)。pH脅迫后,眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中高濃度組(pH9.5) EcMIH基因表達均呈現(xiàn)先上升后下降至初始水平的趨勢,但兩者變化不完全一致,眼柄中EcMIH基因的表達量在3h達到最高(43.86±0.35),12h 達到最低(0.81±0.15),而腹神經(jīng)節(jié)在 24h達到最高(14.58±0.18),低濃度組,眼柄中EcMIH 基因的表達量在 48h達到最高(15.38±0.21),72—96h趨于正常水平,而腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達量在72h達到最高(3.13±0.25),96h趨于正常水平。

圖3 基于MIH-like成熟肽氨基酸序列的NJ進化樹Fig.3 NJ tree based on MIH-like mature peptide amino acid of different species

圖4 EcMIH基因在脊尾白蝦不同組織中的表達分布Fig.4 Distribution of EcMIH gene in different tissues of E. carinicauda

Real-time PCR檢測鹽度脅迫后不同時間脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中 EcMIH基因的表達情況如圖 7所示。鹽度脅迫后,低濃度組(鹽度4、11、18)眼柄中EcMIH基因的表達呈現(xiàn)先升高后下降,而腹神經(jīng)節(jié)為先升高后下降再升高,96h后腹神經(jīng)節(jié)中無論高鹽(鹽度 39、46)還是低鹽(鹽度 4、11、18、25) EcMIH基因的表達量都顯著高于對照組(P＜0.05)。鹽度4脅迫下,眼柄中 EcMIH基因的表達量與對照組相比在3h顯著升高,但6—96h均低于對照組; 鹽度11組在3—96h均低于對照組; 而鹽度18組除3h、24h外均低于對照組。在腹神經(jīng)節(jié)中,低濃度組(鹽度4、11、18、25)在3—96h (72h除外) EcMIH基因的表達量均高于對照組(P＜0.05),但鹽度4在3h達到最高(46.94±0.41),鹽度11、18 在12h達到最高,分別為(5.93±0.32)、(4.12±0.22),鹽度 25 在 24h 達到最高(8.37±0.31)。

圖5 不同pH脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達Fig.5 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different pH treatments at different time同一時間點不同字母者表示差異顯著(P＜0.05),數(shù)據(jù)是3個重復的平均值±標準差,各組表達量均以與0h空白對照組相比較的倍數(shù)表達。下同

圖6 不同pH脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(P＞0.05)Fig.6 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different pH treatments at different time (P＞0.05)

高鹽(鹽度 39、46)脅迫下,眼柄中 EcMIH 基因的表達量在3—96h均高于對照組; 但鹽度39的變化趨勢為先升高后下降的趨勢,而鹽度 46的變化趨勢為先升高后下降再升高的趨勢; 鹽度39脅迫EcMIH基因的表達量在72h達到最高(15.75±0.36),96h趨于正常水平; 鹽度46在6h達到最高(8.09±0.34),12h下降,24h升高,48h下降,72—96h再次顯著升高,分別為(1.77± 0.24)、(2.47±0.21)。

Real-time PCR檢測氨氮脅迫后脊尾白蝦眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中EcMIH基因的表達情況如圖9所示。氨氮脅迫后,眼柄中 EcMIH基因的表達呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢,而腹神經(jīng)節(jié)呈現(xiàn)先下降再升高的趨勢。腹神經(jīng)節(jié)中低濃度組、中高濃度組和高濃度組 EcMIH基因的表達量在 96h均達到最高,分別為(11.07±0.32),(1.28±0.12),(5.10±0.31); 中濃度組在72h達到最高值(8.03±0.35),而眼柄中各氨氮組的變化不完全一致,低濃度組和中高濃度組在3h達到最高(1.88±0.22),(1.32±0.11); 中濃度組在 24h達到最高(4.29±0.31),48—72h表達量下降,96h再次顯著升高(2.26±0.15); 高濃度組在 96 h達到最高(3.80±0.21)。

圖7 鹽度脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達Fig.7 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after salinity stress

圖8 鹽度脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(P＞0.05)Fig.8 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after salinity stress (P＞0.05)

圖9 不同氨氮脅迫后EcMIH基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達Fig.9 The expression of EcMIH gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different NH4Cl treatments at different time

圖10 不同氨氮脅迫后β-actin基因在眼柄(左)和腹神經(jīng)節(jié)(右)中的表達(P＞0.05)Fig.10 The expression of β-actin gene in eyestalk (left) and ventral ganglion (right) after different NH4Cl treatments at different time (P＞0.05)

3 討論

甲殼動物內(nèi)分泌學中眼柄XO-SG系統(tǒng)的研究一直備受關注。MIH是甲殼動物所特有的家族神經(jīng)肽類激素,抑制Y器蛻皮類固醇的合成、抑制蛻皮激素的分泌,對卵巢發(fā)育也有影響,只有當 MIH分泌量減少或停止時才會導致蛻皮現(xiàn)象的發(fā)生。本研究根據(jù)已報道蝦蟹MIH全長cDNA序列比較其同源性,設計簡并引物,克隆得到脊尾白蝦MIH-like基因全長cDNA序列,成熟肽的同源性比較發(fā)現(xiàn),該基因與日本沼蝦MIH-like、羅氏沼蝦MIH-A和遠海梭子蟹 MIH同源性最高,由此可確定脊尾白蝦MIH-like基因為脊尾白蝦的MIH基因。脊尾白蝦MIH成熟肽序列含6個非常保守的半胱氨酸殘基,其N端含有41個氨基酸組成的信號肽,成熟肽與日本囊對蝦(Ohiraet al,2005)一致,由79個氨基酸組成; 通過比較蝦蟹類MIH氨基酸序列信號肽和成熟肽的切割位點,發(fā)現(xiàn)蟹類前2位氨基酸殘基為AA(Leeet al,2007; Stewartet al,2013)或TA(Luet al,2001)而蝦類為SA(Chenet al,2007;Toullecet al,2013); 比較成熟肽氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)其由于近 C-端缺失了幾個氨基酸殘基,C-末端氨基酸序列的保守性較差,具有種間多態(tài)性。短尾類(蟹類)為78個氨基酸?？耸显r(Nagasawaet al,1996)和中國對蝦(王在照等,2003)為75個氨基酸。刀額新對蝦(Tiuet al,2007)為77個氨基酸,南美白對蝦(Sun,1994)為72個氨基酸,鷹爪蝦(王在照等,2002)為71個氨基酸,由此推測MIH在不同蝦體內(nèi)可能有多種不同構型。脊尾白蝦MIH與GIH的同源性很高,與CHH的同源性很低,與其它蝦蟹類 CHH的同源性也很低,這符合CHH家族基因的分類,也說明I型肽和II型肽之間在種內(nèi)和種間存在很大差異。

甲殼動物 MIH的組織表達目前僅見少量報道。刀額新對蝦胚胎期沒有檢測到 MIH基因的表達(Guet al,1998),銹斑蟳(Charybdis feriatus)孵化前的胚胎中檢測到MIH基因的表達(Chanetal,1998),這可能由于物種差異所致; 而在成體側(cè)向地蟹(Gecarcinus lateralis)(Leeet al,2007)、中華絨螯蟹(孫妍等,2011)、凡納濱對蝦(Sun,1994)、日本囊對蝦(Ohiraet al,1997)、可口美青蟹(Callinectes sapidus)(Leeet al,1995)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)(Qiuet al,2003)、刀額新對蝦、銹斑蟳和日本蟳(Charybdis japonica)(沈建明等,2010)的眼柄中均檢測到 MIH的表達,表明眼柄 X器官—竇腺復合體是甲殼動物的重要神經(jīng)內(nèi)分泌器官,通過合成和分泌多種神經(jīng)多肽激素,調(diào)控甲殼動物的性腺發(fā)育、色素反應、蛻皮、代謝、滲透壓調(diào)節(jié)等重要生理活動。而日本囊對蝦、可口美青蟹、鋸緣青蟹、刀額新對蝦和銹斑蟳的 MIH在腦、胸神經(jīng)節(jié)、腹神經(jīng)節(jié)中也有表達,日本蟳 MIH在腦、胸神經(jīng)節(jié)、精巢和卵巢中也有表達。本研究發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦 EcMIH基因在眼柄的表達量最高是卵巢的 830倍; 脊尾白蝦 MIH-like除在眼柄表達外,在腹神經(jīng)節(jié)、心臟、腸、胃和卵巢中也有表達,這表明MIH表達具有較強的組織特異性。而MIH在這些組織的表達與眼柄的表達在功能上是否相同有待進一步研究。

pH、鹽度、氨氮是影響海水養(yǎng)殖蝦蟹類生理生態(tài)的重要環(huán)境因子,可直接影響水生生物的存活、生長、蛻皮、繁殖和免疫活性(蔡生力等,1995)。本文分別研究了不同 pH、鹽度、氨氮脅迫對脊尾白蝦EcMIH基因表達的影響。結果發(fā)現(xiàn),在眼柄中高pH、高氨氮脅迫組(8mg/L)在脅迫 3h后EcMIH基因的表達量均上升,高鹽脅迫組(鹽度 39、46)在脅迫 3—6h后表達量上升,根據(jù)這一應激反應,推測 MIH具有高血糖活性。而在腹神經(jīng)節(jié)中高氨氮(8mg/L)脅迫0—72h脊尾白蝦MIH的高血糖活性受到抑制,96h后MIH的表達量升高,高血糖活性抑制解除。由此推測在高氨氮(8mg/L)的環(huán)境下眼柄為MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官; 在眼柄中,低鹽脅迫下 MIH的高血糖活性受到抑制,鹽度4脅迫,眼柄中EcMIH基因的表達量與對照組相比在3h升高,但6—96h均低于對照組; 鹽度11在3—96h均低于對照組; 而鹽度18除3h、24h外均低于對照組,而腹神經(jīng)節(jié)中,EcMIH基因的表達量在脅迫 3h后開始上升,由此推測低鹽環(huán)境下,腹神經(jīng)節(jié)為MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官。在眼柄中各氨氮脅迫組在脅迫3h后EcMIH基因的表達量均表現(xiàn)升高,而在腹神經(jīng)節(jié)中脅迫3h后EcMIH基因的表達量均表現(xiàn)下降,由此推測氨氮脅迫環(huán)境下眼柄為 MIH高血糖活性的主要調(diào)節(jié)器官。鹽度脅迫72—96h脊尾白蝦MIH基因表達量從低鹽到高鹽的變化趨勢為先升高后降低在升高,此變化趨勢與Lago-Lestón等(2007)用不同溫度鹽度脅迫凡納濱對蝦的結果一致: 他們研究了溫度和鹽度對凡納濱對蝦幼蝦CHH和EcMIH基因的表達變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)在鹽度(18、25、39、46)脅迫24h后,EcMIH基因表達量均顯著增加(P＜0.05); 溫度對基因表達的影響高于鹽度; 鹽度(10,16,22,28,34和 40)和溫度(20°C,24°C,28°C 和 32°C)脅迫 24h,在不同鹽度脅迫下MIH-2基因的表達量明顯低于 MIH-1,且在鹽度 28表達量幾乎為零; 溫度為 20°C和 32°C時MIH基因在不同鹽度脅迫下其表達量高于溫度為24°C和28°C;溫度為28°C時,MIH基因的表達量在不同鹽度脅迫24h后呈下降趨勢,且在鹽度40時MIH基因的表達量最低; 溫度為20°C脅迫24h后,MIH基因的表達量在鹽度16為最高,在鹽度22,28,34表達量下降,在鹽度40表達量上升; Liv-MIH神經(jīng)肽除了受蛻皮抑制活動影響外還可能有其它多效性的影響(比如高血糖活性)。Chang等(1998)利用 ELISA方法研究美洲螯龍蝦,發(fā)現(xiàn)鹽度的降低、升高均能導致 CHH含量的增加。擬穴青蟹鹽度驟變實驗CHH2基因的表達量顯著增加,與本研究的 EcMIH基因表達趨勢基本一致(舒妙安等,2012)。由此可推測出脊尾白蝦EcMIH基因參與了環(huán)境脅迫后的機體應激反應。

4 結論

本研究成功克隆了脊尾白蝦 MIH-like基因全長cDNA序列,初步揭示了pH、鹽度、氨氮脅迫后該基因在眼柄和腹神經(jīng)節(jié)中的表達變化規(guī)律,確定 MIH基因的表達水平與環(huán)境脅迫密切相關,表明該基因參與了環(huán)境脅迫后的機體應激反應,為甲殼動物高血糖激素家族響應環(huán)境脅迫的機理研究提供了參考。

于天基,李 健,李吉濤等,2014. 池養(yǎng)脊尾白蝦的生長與繁殖特性. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標準,4(2): 16—25

王在照,相建海,2002. 編碼鷹爪蝦蛻皮抑制激素基因的cDNA 片段的克隆和序列分析. 水產(chǎn)學報,26(6):487—492

王在照,焦傳珍,張曉軍等,2003. 中國對蝦蛻皮抑制激素全長cDNA的克隆及序列分析. 遺傳學報,30(2): 128—134

任 海,李 健,李吉濤等,2014. 急性氨氮脅迫對脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda) 抗氧化系統(tǒng)酶活力及 GPx基因表達的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,33(4): 647—655

劉 海,2005. 脊尾白蝦在不同鹽度水體中適應性試驗. 蘇鹽科技,(1): 20,30

劉瑞玉,1995. 中國北部的經(jīng)濟蝦類. 北京: 科學出版社,48—49

孫 妍,張亦陳,劉逸塵等,2011. 中華絨螯蟹蛻皮抑制激素基因全長 cDNA克隆和重組表達. 水生生物學報,35(2):210—217

許文軍,謝建軍,施 慧等,2010. 池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)感染血卵渦鞭蟲的研究. 海洋與湖沼,41(3): 396—402

李 洋,劉 萍,李 健,等,2014. 脊尾白蝦酚氧化酶原基因克隆及表達分析. 海洋與湖沼,45(2): 299—306

李 洋,劉 萍,李 健等,2013. 脊尾白蝦絲氨酸蛋白酶抑制劑基因克隆及表達分析. 中國水產(chǎn)科學,20(6): 1166—1174

李美玉,李 健,劉 萍等,2012. 脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)ferritin基因克隆及表達分析. 海洋與湖沼,43(2): 306—312

沈 輝,萬夕和,王李寶等,2013. 白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的致病性研究. 海洋科學,37(5): 55—60

沈建明,朱冬發(fā),楊濟芬等,2010. 日本蟳蛻皮抑制激素基因的克隆及表達分析. 見: 經(jīng)濟發(fā)展方式轉(zhuǎn)變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學技術協(xié)會年會(第三卷),1—8

陳佳蓉,1996. 水化學實驗指導書. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社,1996,136—139

段亞飛,劉 萍,李吉濤等,2013. 脊尾白蝦血細胞全長cDNA文庫的構建及EST序列分析. 中國水產(chǎn)科學,20(2): 243—249

鐘碩良,陳月忠,林克冰等,1997. 蝦池底質(zhì)中NH4+-N、S2-和異養(yǎng)細菌含量的變化及其相關性研究. 臺灣海峽,16(4):449—454

栗治國,2013. 脊尾白蝦繁殖生物學及人工苗種繁育技術的研究. 青島: 中國科學院海洋研究所碩士學位論文

梁俊平,李 健,劉 萍等,2012a. 脊尾白蝦生物學特性與人工繁育的研究進展. 中國農(nóng)學通報,28(17): 109—116

梁俊平,李 健,李吉濤等,2012b. 氨氮對脊尾白蝦幼蝦和成蝦的毒性試驗. 水產(chǎn)科學,31(9): 526—529

舒妙安,張龍韜,周宇芳等,2012. 擬穴青蟹(Scylla paramamosain)兩種Ⅰ型高血糖激素基因全長cDNA的克隆及組織表達分析. 海洋與湖沼,43(4): 695—701

韓俊英,李 健,李吉濤等,2011. 脊尾白蝦熱休克蛋白HSP70基因的克隆及其表達分析. 水產(chǎn)學報,35(8):1130—1138

蔡生力,王崇明,許小幸,1995. 1993年青島流亭鎮(zhèn)對蝦爆發(fā)性流行病調(diào)查. 海洋科學,6: 15—18

Chan S-M,Chen X-G,Gu P-L,1998. PCR cloning and expression of the molt-inhibiting hormone gene for the crab(Charybdis feriatus). Gene,224(1—2): 23—33

Chang E S,Keller R,Chang S A,1998. Quantification of crustacean hyperglycemic hormone by ELISA in hemolymph of the lobster,Homarus americanus,following various stresses. General and Comparative Endocrinology,111(3): 359—366

Chang E S,Prestwich G D,Bruce M J,1990. Amino acid sequence of a peptide with both molt-inhibiting and hyperglycemic activities in the lobster,Homarus americanus.Biochem Biophys Res Commun,171: 818—826

Chen H-Y,Watson R D,Chen J-Cet al,2007. Molecular characterization and gene expression pattern of two putative molt-inhibiting hormones fromLitopenaeus vannamei.General and Comparative Endocrinology,151(1): 72—81

Chen J-C,Liu P-C,Lin Y-Tet al,1988. Super intensive culture of red-tailed shrimpPenaeus penicillatus. Journal of the World Aquaculture Society,19(3): 127—131

De Kleijn D P V,Van Herp F,1995. Molecular biology of neurohormone precursors in the eyestalk of Crustacea.Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,112(4): 573—579

Gu P L,Chan S-M,1998. Cloning of a cDNA encoding a putative molt-inhibiting hormone from the eyestalk of the sand shrimp,Metapenaeus ensis. Molecular Marine Biology and Biotechnology,7(3): 214—220

Katayama H,Nagata K,Ohira Tet al,2003. The solution structure of molt-inhibiting hormone from the Kuruma PrawnMarsupenaeus japonicus. The Journal of Biological Chemistry,278(11): 9620—9623

Lago-Lestón A,Ponce E,Mu?oz M Eet al,2007. Cloning and expression of hyperglycemic (CHH) and molt-inhibiting(MIH) hormones mRNAs from the eyestalk of shrimps ofLitopenaeus vannameigrown in different temperature and salinity conditions. Aquaculture,270(1—4): 343—357

Lee K J,Elton T S,Bej A K,et al,1995. Molecular cloning of a cDNA encoding putative molt-inhibiting hormone from the blue crab,Callinectes sapidus. Biochemical and Biophysical Research Communications,209(3): 1126—1131

Lee K J,Kim H-W,Gomez A Met al,2007. Molt-inhibiting hormone from the tropical land crab,Gecarcinus lateralis:Cloning,tissue expression,and expression of biologically active recombinant peptide in yeast. General and Comparative Endocrinology,150(3): 505—513

Lin C Y,Chen S H,Kou G Het al,1998. Identification and characterization of a hyperglycemic hormone from freshwater giant prawn,Macrobrachium rosenbergii.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular & Integrative Physiology,121(4): 315—321

Lorenzon S,Francese M,Ferrero E A,2000. Heavy metal toxicity and differential effects on the hyperglycemic stress response in the shrimpPalaemon elegans. Archives of Environmental Contamination Toxicology,39(2): 167—176

Lu W Q,Wainwright G,Olohan L Aet al,2001. Characterization of cDNA encoding molt-inhibiting hormone of the crab,Cancerpagurus; expression ofMIHin non-X-organ tissues.Gene,278(1—2): 149—159

Nagasawa H,Yang W-J,Shimizu Het al,1996. Isolation and amino acid sequence of a molt-inhibiting hormone from the American crayfish,Procambarusclarkii. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,60(3): 554—556

Ohira T,Watanabe T,Nagasawa Het al,1997. Molecular cloning of a moil-inhibiting hormone cDNA from the kuruma prawnPenaeus japonicus. Zoological Science,14(5):785—789

Ohira T,Katayama H,Tominaga Set al,2005. Cloning and characterization of a molt-inhibiting hormone-like peptide from the prawnMarsupenaeus japonicus. Peptides,26(2):259—268

Qiu G F,Zhang A P,Lou Y D,2003. cDNA cloning and expression analysis of molt-inhibiting hormone in the mud crabScyllaserrata. Journal of Fisheries of China,27(3):207—212

Santos E A,Keller R,1993. Effect of exposure to atmospheric air on blood glucose and lactate concentrations in two crustacean species: A role of the Crustacean hyperglycemic hormone (CHH). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology,106(2): 343—347

Sedlmeier D,1988. The crustacean hyperglycemic hormone(CHH) releases amylase from the crayfish midgut gland.Regulatory Peptides,20(2): 91—98

Stentiford G D,Chang E S,Neil D M,2001. Carbohydrate dynamics and the crustacean hyperglycemic hormone (CHH):Effects of parasitic infection in Norway lobsters (Nephrops norvegicus). General and Comparative Endocrinology,121(1): 13—22

Stewart M J,Stewart P,Sroyraya Met al,2013. Cloning of the crustacean hyperglycemic hormone and evidence for molt-inhibiting hormone within the central nervous system of the blue crabPortunus pelagicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular &Integrative Physiology,164(2),276—290

Sun P S,1994. Molecular cloning and sequence analysis of a cDNA encoding a molt-inhibiting hormone-like neuropeptide from the white shrimpPenaeus vannamei.Molecular Marine Biology and Biotechnology,3(1): 1—6

Tiu S H-K,Chan S-M,2007. The use of recombinant protein and RNA interference approaches to study the reproductive functions of a gonad-stimulating hormone from the shrimpMetapenaeus ensis.FEBS Journal,274(17): 4385—4395

Toullec J-Y,Corre E,Bernay Bet al,2013. Transcriptome and peptidome characterisation of the main neuropeptides and peptidic hormones of a euphausiid: the ice krill,Euphausia crystallorophias. PLoS One,8(8): e71609

Webster S G,1996. Measurement of crustacean hyperglycaemic hormone levels in the edible crabCancer pagurusduring emersion stress. The Journal of Experimental Biology,199(Pt7): 1579—1585