蔣經(jīng)偉 程雨卉, 周遵春① 董 穎 陳 仲 姜 北 高 杉

(1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 大連 116023; 2. 大連海洋大學(xué) 大連 116023)

酚氧化酶(PO)是無(wú)脊椎動(dòng)物非特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中的關(guān)鍵免疫因子,緊密參與抗菌、抑菌、病原清除等多種免疫應(yīng)答過(guò)程(Mu?ozet al,2006;Cereniuset al,2008; 吳曙等,2009)。PO自身不具有任何的抗菌、抑菌活性,其免疫功能是通過(guò)氧化底物反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的(S?derh?llet al,1998; Aladailehet al,2007)。在 O2存在的條件下,PO將酚類(lèi)底物(如多巴胺、左旋多巴等)氧化成醌,醌通過(guò)非酶促反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化成黑色素,非酶促反應(yīng)中生成的活性中間代謝產(chǎn)物和黑色素不僅具有顯著的抗菌、抑菌活性,還參與血細(xì)胞遷移、結(jié)節(jié)和包囊形成、損傷修復(fù)等其他免疫應(yīng)答活動(dòng)(Baiet al,1997; Ballarinet al,1998; Cereniuset al,2004)。

關(guān)于酚氧化酶氧化產(chǎn)物的抗菌特性研究在一些無(wú)脊椎動(dòng)物物種已有報(bào)道。在煙草天蛾Manduca sexta中,純化的PO與多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)受試的革蘭氏陰性(G–)細(xì)菌(大腸桿菌Escherichia coli,肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonia,綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa,鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhimurium)和革蘭氏陽(yáng)性(G+)細(xì)菌(蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus,枯草桿菌Bacillus subtilis,藤黃微球菌Micrococcus luteus,金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的生長(zhǎng)均有強(qiáng)烈抑制作用,而PO與左旋多巴的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)上述細(xì)菌的生長(zhǎng)幾乎無(wú)明顯影響(Zhaoet al,2007)。除具有抗菌活性外,煙草天蛾P(guān)O與多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物還對(duì)紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)、噬菌體和寄生黃蜂Microplitis demolitor的卵有顯著抑制作用(Zhaoet al,2011)。淡水龍蝦Pacifastacus leniusculus血細(xì)胞破碎液上清(HLS)與多巴胺的混合物對(duì)受試的 G–細(xì)菌(嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、大腸桿菌、綠膿假單胞菌)和 G+細(xì)菌(蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae)也有強(qiáng)烈抑制作用,此外,與煙草天蛾中的結(jié)果相似,淡水龍蝦 HLS與左旋多巴的混合物對(duì)上述細(xì)菌的抑制作用較弱,甚至無(wú)抑制作用(Cereniuset al,2010)。PO與多巴胺反應(yīng)產(chǎn)物的抗菌活性高于PO與左旋多巴反應(yīng)產(chǎn)物這一現(xiàn)象在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物櫛孔扇貝Chlamys farreri和仿刺參Apostichopus japonicus中也有發(fā)現(xiàn),然而,在上述兩個(gè)物種中,PO氧化產(chǎn)物僅對(duì)受試細(xì)菌中的部分細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌活性(Xinget al,2012; Jianget al,2014)。純化的櫛孔扇貝PO與多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物僅對(duì)溶藻膠弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus和殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida有顯著抑制作用,而對(duì)停乳鏈球菌Streptococcus dysgalactiae、海豚鏈球菌Streptococcus iniae、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和愛(ài)德華氏菌Edwardsiella tarda的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(Xinget al,2012)。在仿刺參中,純化出3種PO (AjPO1,AjPO2,AjPO3),其中AjPO1、AjPO3與多巴胺反應(yīng)產(chǎn)物均可抑制燦爛弧菌Vibrio splendidus和哈維氏弧菌Vibrio harveyi的生長(zhǎng),3種PO與多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)希瓦氏菌Shewanella baltica、假交替單胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、擬諾卡式菌Nocardiopsissp.的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(Jianget al,2014)。此外,在太平洋牡蠣Crassostrea gigas中,血細(xì)胞破碎液上清與左旋多巴的混合物對(duì)燦爛弧菌和河口弧菌Vibrio aestuarianus有顯著抑制作用(Luna-Acostaet al,2011)。上述研究表明,PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性除了取決于底物種類(lèi)外,還與PO所屬物種或PO種類(lèi)有關(guān)。

光棘球海膽Strongylocentrotus nudus屬于棘皮動(dòng)物門(mén),又稱(chēng)大連紫海膽,是中國(guó)北方近海重要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種(湛垚垚等,2013)。近年來(lái),隨著海膽?zhàn)B殖規(guī)模的擴(kuò)大,養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)一系列病害問(wèn)題,影響了海膽?zhàn)B殖的發(fā)展(王斌等,2006; 周瑋等,2008)。了解光棘球海膽的免疫特性對(duì)預(yù)防和控制海膽病害具有重要意義,而目前關(guān)于海膽PO的研究主要是體腔液中的PO活力分析(王軼南等,2011),尚缺乏PO純化和PO氧化產(chǎn)物抗菌特性研究的報(bào)道。因此本文分離純化了光棘球海膽體腔液中的 PO,并分析了光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性,以期為海膽免疫機(jī)制的研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)(23.6 ± 4.4)5只,取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心,于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)(水溫17—18°C,pH 8.6—8.8,鹽度29),備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

以燦爛弧菌、哈維氏弧菌、假交替單胞菌、希瓦氏菌、金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、溶壁微球菌和擬諾卡式菌為受試細(xì)菌(菌株信息見(jiàn)表 1),測(cè)定光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌譜和抗菌活力。上述細(xì)菌在 28°C、150 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,取細(xì)菌培養(yǎng)懸液于 4°C、6000 ×g離心 20 min,棄上清,用生理鹽水重懸細(xì)菌沉淀至終濃度為A600=1.0。

表1 受試細(xì)菌信息Tab.1 The information of the bacteria tested

1.3 體腔液上清的制備

用滅菌注射器穿透光棘球海膽(5只)的圍口膜抽取體腔液。將 5只海膽的體腔液混勻后,離心(4°C,3500 r/min,10 min),取上清作為體腔液上清(CFS),凍存于–20°C備用。

1.4 光棘球海膽PO的分離純化

采用 Jiang等(2014)報(bào)道的線性連續(xù)梯度非變性電泳結(jié)合鄰苯二酚發(fā)色法分離光棘球海膽體腔液上清中的 PO。具體步驟如下: 以 CFS為樣品,在濃度范圍為 6%—27%的線性連續(xù)梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳 8 h (4°C,恒流 20 mA),使用分子量范圍為21—720 kDa的非變性電泳Marker(SERVA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 電泳結(jié)束后,將凝膠中的一條泳道切下,浸于1%鄰苯二酚溶液中發(fā)色5 min,定位PO條帶; 根據(jù)鄰苯二酚發(fā)色結(jié)果,將未發(fā)色凝膠中的PO條帶切下,浸于生理鹽水中高速勻漿1 min,然后于4°C、14000 r/min離心30 min,取上清作為部分純化的光棘球海膽PO溶液,凍存于–20°C備用。

1.5 光棘球海膽PO活力測(cè)定

采用多巴絡(luò)合物生成法(S?derh?ll,1981)測(cè)定PO活力。使用左旋多巴或多巴胺(Sigma)作為底物,100 μL PO溶液與2.0 mL 20 mmol/L底物溶液混勻后,在490 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定吸光值,A490值每分鐘增加0.001定義為1個(gè)活力單位(U)。分別以左旋多巴、多巴胺為底物,將分離得到的各PO溶液調(diào)成400 U/mL,用于抗菌活性分析。

1.6 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性分析

分別使用左旋多巴或多巴胺作為底物。100 μL細(xì)菌懸液、50 μL PO溶液與150 μL 20 mmol/L底物溶液(溶于生理鹽水)混勻后于30°C孵育1 h。孵育后的混合物離心(4°C,6000 r/min) 7 min,棄上清,將細(xì)菌沉淀用 500 μL生理鹽水重懸后,再離心(4°C,6000 r/min)7 min,棄上清,最后將細(xì)菌沉淀接種到3 mL 2216E培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)(28°C,150 r/min)。培養(yǎng)過(guò)程中,每隔1 h取100 μL細(xì)菌培養(yǎng)懸液測(cè)定A600。對(duì)照組包括以下3種孵育方式: (1) 100 μL細(xì)菌懸液、50 μL 生理鹽水與 150 μL 20 mmol/L 底物溶液(溶于生理鹽水)混勻后于30°C孵育1 h; (2) 100 μL細(xì)菌懸液、50 μL PO溶液與150 μL生理鹽水混勻后于30°C孵育1 h; (3) 100 μL細(xì)菌懸液與200 μL生理鹽水混勻后于30°C孵育1 h。其中,對(duì)照(1)用于檢測(cè)PO底物對(duì)受試細(xì)菌生長(zhǎng)的影響,對(duì)照(2)用于檢測(cè)光棘球海膽 PO自身對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響,對(duì)照(3)用作空白對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)PO與底物處理后的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線同時(shí)低于對(duì)照(1)、(2)、(3)中的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線,且對(duì)照(1)和(2)中的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線與對(duì)照(3)中的相比無(wú)明顯差別時(shí),定義PO與底物的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)該細(xì)菌有抗菌作用。

1.7 數(shù)據(jù)分析

抗菌活性中檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5分析計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 光棘球海膽PO的分離純化

非變性電泳后,經(jīng)鄰苯二酚發(fā)色,共發(fā)現(xiàn) 3條PO條帶,分別呈現(xiàn)褐色、黃色和紫色(圖1)。3種PO按分子量由高到低分別命名SnPO1、SnPO2、SnPO3,3種PO的分子量均小于 Marker中的最小標(biāo)準(zhǔn)蛋白,其中 SnPO2的分子量與溴酚藍(lán)指示劑相近,而SnPO3在非變性電泳中的遷移速率要大于溴酚藍(lán)指示劑。

圖1 光棘球海膽體腔液上清非變性電泳圖Fig.1 Native-PAGE of the supernatant of coelomic fluid from S. nudus1: 非變性電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 2: 光棘球海膽體腔液上清考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果; 3: 光棘球海膽體腔液上清PO定位結(jié)果

2.2 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌活性分析

與空白對(duì)照組相比,光棘球海膽中的3種PO對(duì)受試的 8株細(xì)菌的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響(數(shù)據(jù)在結(jié)果中省略)。

在受試的4株G–細(xì)菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌和哈維氏弧菌有顯著抗菌作用(圖 2)。當(dāng)以多巴胺為底物時(shí),SnPO1的氧化產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌和哈維氏弧菌的生長(zhǎng)均有抑制作用,而 SnPO2和SnPO3的氧化產(chǎn)物僅抑制哈維氏弧菌的生長(zhǎng); 以左旋多巴為底物時(shí),光棘球海膽中3種PO的氧化產(chǎn)物對(duì)4種G–細(xì)菌的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響。

在受試的4株G+細(xì)菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有顯著抗菌作用(圖 3)。多巴胺對(duì)停乳鏈球菌有抑制作用,因此光棘球海膽PO與多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)停乳鏈球菌的抗菌作用無(wú)法判斷。當(dāng)以多巴胺為底物時(shí),SnPO1氧化產(chǎn)物僅抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),SnPO3氧化產(chǎn)物僅抑制擬諾卡式菌的生長(zhǎng),而 SnPO2氧化產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌的生長(zhǎng)均有抑制作用; 以左旋多巴為底物時(shí),SnPO2氧化產(chǎn)物對(duì)擬諾卡式菌的生長(zhǎng)有抑制作用,SnPO1和SnPO3的氧化產(chǎn)物對(duì)4種G+細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

3 討論

PO作為無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的重要免疫因子,通過(guò)與底物反應(yīng)生成的產(chǎn)物直接參與殺菌和抑菌過(guò)程(Baiet al,1997; Ballarinet al,1998; Cereniuset al,2004)。已有的研究表明,不同物種PO的氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的抗菌特性(Zhaoet al,2007; Xinget al,2012;Jianget al,2014),而海膽在養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常受到細(xì)菌病害的影響(王斌等,2006; 周瑋等,2008),因此了解光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物的抗菌特性對(duì)通過(guò)免疫手段預(yù)防和控制海膽細(xì)菌病害具有重要意義。

圖2 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)G–細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effects of PO oxidation products on growth of Gram-negative bacteriaa: 燦爛弧菌; b: 哈維氏弧菌; c: 假交替單胞菌; d: 希瓦氏菌

不同于菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum、櫛孔扇貝和大鰲蝦Panulirus argus中檢測(cè)到的單條PO帶(Perdomo-Moraleset al,2007; 蔣經(jīng)偉等,2012;Xinget al,2012),在本研究中,作者從光棘球海膽體腔液上清中分離得到3種PO。光棘球海膽中3種PO的分子量非常小,而且在非變性聚丙烯酰胺凝膠中與鄰苯二酚反應(yīng)分別呈現(xiàn)褐色、黃色和紫色的條帶,與仿刺參中的結(jié)果(Jianget al,2014)非常相似,表明光棘球海膽和仿刺參中的PO系統(tǒng)在進(jìn)化上具有很高的同源性。以左旋多巴或多巴胺為底物時(shí),光棘球海膽PO的氧化產(chǎn)物僅對(duì)哈維氏弧菌、燦爛弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抑制作用,而對(duì)假交替單胞菌、希瓦氏菌和溶壁微球菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響,表明光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物具有窄譜抗菌活性,與櫛孔扇貝和仿刺參中的結(jié)果相似(Xinget al,2012;Jianget al,2014),不同于煙草天蛾和淡水龍蝦PO氧化產(chǎn)物的廣譜抗菌活性(Zhaoet al,2007; Cereniuset al,2010)。在受試的G–細(xì)菌中,光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)弧菌有顯著的抗菌作用,與太平洋牡蠣、櫛孔扇貝和仿刺參等海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中的結(jié)果非常相似(Luna-Acostaet al,2011; Xinget al,2012; Jianget al,2014)。由于弧菌是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中最常見(jiàn)的致病菌之一,上述結(jié)果表明,PO氧化產(chǎn)物對(duì)弧菌的顯著抗菌作用可能是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物PO免疫系統(tǒng)適應(yīng)性進(jìn)化的結(jié)果。光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物還對(duì)部分G+細(xì)菌有抗菌作用,與櫛孔扇貝中的結(jié)果明顯不同。在櫛孔扇貝中,PO氧化產(chǎn)物僅對(duì)部分 G–細(xì)菌有抗菌作用,而對(duì)G+細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(Xinget al,2012)。光棘球海膽PO和仿刺參PO在亞型組成和鄰苯二酚顯色反應(yīng)上具有很高的相似性,然而在氧化產(chǎn)物抗菌譜上還是有顯著的差異。光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物顯著抑制擬諾卡式菌的生長(zhǎng),而仿刺參PO氧化產(chǎn)物對(duì)擬諾卡式菌無(wú)明顯的抗菌作用(Jianget al,2014)。這一結(jié)果進(jìn)一步證明,不同物種間PO氧化產(chǎn)物的抗菌譜是有明顯差異的。此外,SnPO1氧化產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌、哈維氏弧菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用,SnPO2氧化產(chǎn)物對(duì)哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抑制作用,而 SnPO3氧化產(chǎn)物僅對(duì)哈維氏弧菌和擬諾卡式菌有抑制作用,表明同一物種的不同 PO亞型之間,氧化產(chǎn)物的抗菌譜也存在差異,與仿刺參中報(bào)道的結(jié)果相似(Jianget al,2014)。本研究還發(fā)現(xiàn),多巴胺氧化產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌、哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌和擬諾卡式菌有抗菌作用,而左旋多巴氧化產(chǎn)物僅對(duì)擬諾卡式菌有抗菌作用,表明在光棘球海膽中PO與多巴胺反應(yīng)產(chǎn)物的抗菌活力高于PO與左旋多巴的反應(yīng)產(chǎn)物。在其他一些無(wú)脊椎動(dòng)物如煙草天蛾、淡水龍蝦、櫛孔扇貝和仿刺參中也發(fā)現(xiàn)多巴胺氧化產(chǎn)物的抗菌活力高于左旋多巴氧化產(chǎn)物(Zhaoet al,2007; Cereniuset al,2010; Xinget al,2012; Jianget al,2014)。有報(bào)道認(rèn)為多巴胺氧化產(chǎn)物與左旋多巴氧化產(chǎn)物抗菌活力的差異是由PO催化底物后生成產(chǎn)物的成分不同造成的,PO與多巴胺反應(yīng)后生成二羥吲哚,二羥吲哚及其自氧化產(chǎn)物被證明具有很強(qiáng)的殺菌、抑菌作用,而PO與左旋多巴反應(yīng)后生成多巴醌,多巴醌及其自氧化產(chǎn)物僅具有微弱抗菌作用(Nappiet al,1992; Zhaoet al,2007)。上述推論可以從一定程度上解釋多巴胺氧化產(chǎn)物與左旋多巴氧化產(chǎn)物的抗菌活性差異,然而該推論尚無(wú)法解釋不同PO間多巴胺氧化產(chǎn)物在抗菌譜和抗菌特性上的差異,PO氧化產(chǎn)物的抗菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖3 光棘球海膽PO氧化產(chǎn)物對(duì)G+細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effects of PO oxidation products on growth of Gram-positive bacteriaa: 金黃色葡萄球菌; b: 停乳鏈球菌; c: 溶壁微球菌; d: 擬諾卡式菌

致謝擬諾卡式菌(Nocardiopsissp.)由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組惠贈(zèng),謹(jǐn)致謝忱。

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