劉 青 劉 皓 吳旭干 何 杰 董鵬生 王幼鵬 成永旭①

(1. 上海海洋大學 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 太谷

030801; 3. 上海海洋大學 上海市教委水產(chǎn)動物遺傳育種協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306; 4. 江蘇省宿遷旭邦水產(chǎn)科技有限公司泗洪 223900)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹(以下簡稱河蟹),是中國重要的淡水養(yǎng)殖種類,2012年全國養(yǎng)殖總產(chǎn)量達714400 t (王武等,2013)。我國河蟹天然群體曾廣泛分布于遼河、黃河、長江、甌江和閩江等水系,野生資源豐富(許加武等,1997; Suiet al,2009)。但是,20世紀70年代以來,由于過渡捕撈、入海和沿江河流的水閘阻擋河蟹洄游通道及環(huán)境污染等原因,各水系河蟹野生資源急劇下降,成蟹捕撈產(chǎn)量逐年下降,難以滿足市場需求(Chenget al,2008)。另一方面,隨著人們生活水平的提高,河蟹的消費量不斷增加,這種狀況極大促進了河蟹增養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展(Suiet al,2011)。20世紀80年代河蟹人工育苗技術(shù)取得突破以后,其人工養(yǎng)殖在我國大部分地區(qū)得以迅速發(fā)展,目前養(yǎng)殖較集中的區(qū)域為長江流域、黃河流域和遼河流域,其中長江流域養(yǎng)殖規(guī)模、總產(chǎn)量和成蟹平均規(guī)格均占首位(崔江華,2010;王武等,2013; 趙娜,2014)。由于不同水系河蟹的養(yǎng)殖性能和蟹種價格相差較大(李勇等,2001; 李晨虹等,2002),通常認為長江水系河蟹養(yǎng)殖性能最佳,因此20世紀90年代其它水系的河蟹蟹種被引入長江流域滿足蟹種需求的缺口; 另一方面,長江水系蟹種也被引入黃河和遼河流域進行池塘養(yǎng)殖希望獲得更好的養(yǎng)殖效果,這種水系間的盲目引種及養(yǎng)殖導致河蟹種質(zhì)混雜、養(yǎng)殖性能退化(王武等,2007)。此外,河蟹人工繁育過程中,許多育苗場為了降低親本費用,通常采用小規(guī)格池塘養(yǎng)殖親本進行育苗,經(jīng)過多代人工繁育和養(yǎng)殖,致使河蟹養(yǎng)殖群體的種質(zhì)退化,養(yǎng)殖性能下降(Suiet al,2011; 王武等,2013)。因此,系統(tǒng)研究我國現(xiàn)有主要野生和養(yǎng)殖群體河蟹的遺傳多樣性、遺傳分化和種群結(jié)構(gòu)等,對其種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實意義(朱清順等,2008; 張世勇等,2013)。

近 10年來,由于河蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加和主要水系禁漁期的執(zhí)行,使得野生河蟹的捕撈強度有所降低,加上各水系開展河蟹增殖放流和水域生態(tài)環(huán)境保護等,長江、黃河和遼河等水系河蟹野生資源在一定程度上得以恢復(周剛等,2003; 施德龍,2006; 劉凱等,2013),這為各水系野生河蟹的種質(zhì)資源評價和優(yōu)異種質(zhì)發(fā)掘利用提供了物質(zhì)基礎。先前有研究報道了長江和遼河水系野生河蟹的遺傳特性和種群結(jié)構(gòu)等(李思發(fā)等,1999; 李海燕等,2003; Suiet al,2009;龔疏影等,2009),但是這些研究樣品多采集于 2000年前后,無法準確反應當前各水系河蟹的種質(zhì)資源的現(xiàn)狀。另外,近 10多年來各水系野生河蟹均經(jīng)歷了野生群體數(shù)量下降、水系間盲目引種、養(yǎng)殖群體逃逸和增殖放流等人工干擾,這可能會對三水系河蟹野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)造成一定的影響,因此需要對現(xiàn)存三水系野生群體的遺傳特性進行科學評估。先前有關河蟹遺傳特征的研究報道主要是針對各水系野生群體(Herborget al,2007; Changet al,2008; Suiet al,2009),尚缺乏對我國三個主產(chǎn)水系現(xiàn)存野生和養(yǎng)殖群體遺傳特性的比較研究,這非常不利于我國河蟹種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用工作。

DNA微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeat,SSR)多態(tài)性來源于其核心序列重復次數(shù)的變化,具有信息含量豐富、多態(tài)性高、個體特異性強、共顯性遺傳等優(yōu)點,比RFLP、RAPD、AFLP等分子標記更能揭示動物的遺傳特性,因此在種質(zhì)資源評價和遺傳育種中得到了廣泛的應用(Baker,1994; Bentzenet al,2001)。目前,SSR已經(jīng)被應用于河蟹的種群遺傳和遺傳育種中(Herborget al,2007; Changet al,2008; Suiet al,2009; 李曉暉等,2010),但是以往研究采用的SSR標記數(shù)量較少,且沒有同時對我國現(xiàn)有主要野生和養(yǎng)殖群體河蟹的遺傳特征進行系統(tǒng)評估。鑒于此,本研究篩選了29對多態(tài)性較高的SSR標記,比較了長江、黃河和遼河水系野生及養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性、遺傳分化、瓶頸效應和遺傳結(jié)構(gòu),以評估我國主要水系河蟹野生和養(yǎng)殖和群體的遺傳特性,為進一步開展河蟹野生種質(zhì)資源保護、優(yōu)異種質(zhì)挖掘利用和遺傳育種等提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

長江野生群體(YW)、黃河野生群體(HW)和遼河野生群體(LW)河蟹分別于2013年10—12月份采集于上海崇明縣(121.18°E,31.76°N),山東東營市利津縣(118.52°E,37.61°N),遼寧盤錦市大洼縣(122.70°E,40.70°N); 長江養(yǎng)殖群體(YP)、黃河養(yǎng)殖群體(HP)和遼河養(yǎng)殖群體(LP)河蟹分別采集于上海市崇明縣(121.26°E,31.74°N),山東東營市墾利縣(118.74°E,37.59°N),遼寧盤錦市大洼縣(122.08°E,41.01°N)的河蟹養(yǎng)殖場(圖1)。每個群體分別隨機采集60只成蟹,體重為96—208g。分別取其附肢肌肉,用95%乙醇固定后在–20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 河蟹6群體的采樣地點Fig.1 Sampling location of six populations of E. sinensis

1.2 DNA提取

采用改進的酚-氯仿法提取河蟹基因組 DNA(劉皓等,2015),采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性,采用微量紫外分光光度計(型號: Q5000,美國Quawell公司生產(chǎn))檢測DNA質(zhì)量和濃度,ddH2O稀釋至50ng/μL待PCR用。

1.3 引物篩選和PCR擴增

從已報道的河蟹 SSR引物中選擇 29對多態(tài)性高、擴增效果好的引物用于本研究,其中Esin18,Esin36,Esin42,Esin55,Esin67,Esin87引物序列參考H?nfling 等(2003);HLJEsd02,HLJEsc11,HLJEsc20,HLJEsb25,HLJEsc34,HLJEsa42,HLJEsd52,HLJEsc56,HLJEsc65,HLJEsa67,HLJEsa69,HLJEsa76,HLJEsc86,HLJEsb88引物序列參考 Chang等(2006);JPX-3,JPX-10,JPX-13引物序列參考Cheng等(2010);Q67,Q703,Q726,Q732,Q840,Q934引物序列參考熊良偉(2014)。所有正向(5'端)引物采用熒光標記(FAM 或HEX),反向(3'端)為普通引物。PCR反應體系總體積為 10μL,包括 50ng DNA 模板、1μL10×PCR buffer、200μmol/L dNTP、各 0.5μmol/L正反向引物和 0.5U Taq聚合酶,然后用ddH2O補充至10μL,所需試劑均購于 Takara公司)。采用降落式 PCR反應程序進行SSR標記擴增,以提高熒光引物的結(jié)合效率,減少雜帶(Suiet al,2009),具體PCR程序為: 94°C預變性3min; 93°C 變性 1min,(退火溫度+6°C)退火 30s,72°C延伸1min,2個循環(huán); 93°C變性1min,(退火溫度+4°C)退火30s,72°C延伸1min,2個循環(huán); 89°C變性1min,(退火溫度+2°C)退火 30s,72°C延伸 1min,5個循環(huán);89°C變性1min,(正常退火溫度)退火30s,72°C延伸1min,20—25個循環(huán); 72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物于–20°C 保存待用。

根據(jù)不同SSR位點的PCR產(chǎn)物片段長度范圍的差別,挑選 2—3個不同熒光標記且長度相差較大的SSR位點PCR產(chǎn)物,將其混合后利用后全自動DNA測序儀進行分析(型號: ABI-3730XL,美國ABI公司),采用GeneMaper-3.5軟件掃描峰圖后讀取目的片段的長度,將數(shù)據(jù)導入 Microsoft excel中整理以備分析(馬雪霞等,2007; 劉皓等,2015)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各位點基因片段的長度和,確定每個樣品各SSR位點的基因型。利用 POPGEN 3.2軟件計算各位點的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、香農(nóng)信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、固定指數(shù)(FIS)(Nei,1978); 采用 PIC_CALC 0.6軟件計算多態(tài)信息含量(PIC)(王婷等,2014),按照參考文獻Botstein等(1980)的標準,當某位點PIC＞0.5時,該位點為高多態(tài)性位點; 利用 ARLEQUIN 3.5軟件的馬爾科夫鏈(MarkovChain)方法對各位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗(Exoffieret al,2010)。

利用POPGEN 32軟件計算群體間的 Nei’s遺傳距離(Nei,1978),基于此距離采用MEGA 5.0軟件作UPGMA系統(tǒng)樹(Tamuraet al,2011); 用 ARLEQUIN 3.5軟件計算群體遺傳分化的 F-統(tǒng)計量(F-statistics,FST),FST＜0.05 為輕微分化(Ballouxet al,2002)。分子方差分析(AMOVA)分析變異來源(Exoffieret al,2010)。

基于無限等位基因模型(Infinite Allele Model,IAM)、雙相突變模型(Two-phased Model of Mutation,TPM)及逐步突變模型(Step-wise Mutation Model,SMM),用BOTTLENECK 3.4軟件進行瓶頸效應分析,采用符號檢驗(Sign Test)和 Wilcoxon符號秩序測試(Wilcoxon Sign-rank Test)來確定雜合度過剩是否顯著(Maruyamaet al,1985); 采用STRUCTURE 2.3軟件對群體結(jié)構(gòu)進行分析,分析最佳K值,以確定群體遺傳結(jié)構(gòu)的理論群體數(shù)(Pritchardet al,2000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點多態(tài)性及群體的遺傳多樣性

本研究選用了 29個河蟹微衛(wèi)星位點,在 6個群體中均實現(xiàn)成功擴增(表 1)。共檢測到 943個等位基因,各位點等位基因數(shù)(Na)介于 11—52之間(圖 2),平均為 32.52,有效等位基因數(shù)(Ne)在 1.844—31.269之間,平均為 15.637; 各位點觀測雜合度(Ho)在0.444—0.941之間,平均為 0.723,期望雜合度He介于 0.458—0.969,平均為 0.876; 平均多態(tài)信息含量PIC=0.864,除位點 Esin87外,其余位點均為高多態(tài)性位點(PIC＞0.5); 平均香農(nóng)信息指數(shù)I=2.732; 位點Esin87、HLJEsa42、HLJEsc34、Q67、Q703處于Hardy-Weinberg平衡,其余位點均顯著或極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(P＜0.05)。

6個群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)見表2。整體上,6個群體的平均等位基因數(shù)(Na)、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均觀測雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和平均香農(nóng)指數(shù)(I)接近,各群體的遺傳多樣性水平均較高。就近交系數(shù)(FIS)值而言,6個群體間存在一定的差異,其中遼河養(yǎng)殖群體最高,黃河養(yǎng)殖群體最低,大小順序依次為: 遼河養(yǎng)殖＞長江野生＞遼河野生＞長江養(yǎng)殖=黃河野生＞黃河養(yǎng)殖。就各位點群體內(nèi)FIS而言,除Esin67位點為負值(–0.016)外,其余均為正值。

2.2 群體的遺傳分化

6個群體的遺傳分化情況見表3。除長江野生與黃河野生群體(FST=0.0040)、長江野生與遼河養(yǎng)殖群體(FST=0.0 0 5 0)、黃河養(yǎng)殖與遼河養(yǎng)殖群體(FST=0.0034)的遺傳分化極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)外,其余群體之間的遺傳分化不顯著; 所有種群間的遺傳分化均屬輕微程度的分化(FST＜0.05)。Nei’s遺傳距離數(shù)據(jù)(Ds)與F-統(tǒng)計值(FST)的結(jié)果基本一致,長江野生與遼河養(yǎng)殖群體遺傳距離最大(Ds=0.0989),其次為長江野生與黃河野生(Ds=0.0968),長江養(yǎng)殖與黃河野生群體的遺傳距離最小(Ds=0.0664)(表 3)。

表1 6個群體河蟹29個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性Tab.1 Genetic polymorphism of the 29 microsatellite loci in six populations of E. sinensis

圖2 6個群體河蟹各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)量Fig.2 Number of Allele for the different SSR loci in the six populations of E. sinensis

表2 河蟹6個群體的遺傳多樣性統(tǒng)計Tab.2 Genetic diversity statistics of E. sinensis for the six populations

表3 Nei’s遺傳距離(Ds,對角線以下)及F-統(tǒng)計值(FST,對角線以上)Tab.3 Genetic distances (Ds,below diagonal) and genetic differentiation coefficient (FST,above diagonal) for the six populations of E. sinensis

基于Nei’s遺傳距離的UPGMA進化樹結(jié)果顯示,長江野生群體單獨聚為一支,其余5群體共同聚為大一支,其中長江養(yǎng)殖群體、黃河野生群體與黃河養(yǎng)殖群體聚為一小支,遼河野生群體和養(yǎng)殖群體聚為另一小支,這兩小支共同形成一大支,它們與長江野生群體并列。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示,14.02%的遺傳變異來自種群內(nèi)個體間,85.88%的變異來自個體內(nèi),來源于群體之間的差異僅占到0.10%(表4)。

2.3 瓶頸效應分析

29個微衛(wèi)星位點的期望雜合度(He)與在3個模型下的平均期望雜合度(Heq)見表5。在IAM模型下,除Esin87、Esin67之外,其它位點的He均大于Heq,有13個位點無顯著差異,其余位點均有顯著或極顯著差異; 在TPM模型下,8個位點的He小于Heq,其余位點He大于Heq,4個位點差異顯著(P＜0.05),其余位點無顯著差異; 在 SMM 模型下,位點 17個位點的He小于Heq,其余位點He大于Heq,共 5個位點差異顯著(P＜0.05),其中位點Esin87、Esin67在 TPM 和SMM模型下均差異極顯著(P＜0.01)。

表4 6個種群分子方差分析(AMOVA)Tab.4 AMOVA results for the six populations of E. sinensis

圖3 基于Nei’s遺傳距離的6個河蟹群體UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA clustering tree of E. sinensis based on Nei’ s genetic distance among populations

河蟹6群體突變-漂移平衡分析如表6所示。在符號檢驗中,IAM模型下 6個群體均表現(xiàn)為雜合度過高,顯著或極顯著偏離突變-漂移平衡; TPM模型下幾個群體亦表現(xiàn)為雜合過度,但只有黃河野生和黃河養(yǎng)殖群體顯著偏離平衡(P＜0.05); 在 SSM 模型下,所有群體均表現(xiàn)出一定程度的雜合不足,除黃河養(yǎng)殖群體外,其余 5個群體顯著或極顯著偏離平衡。Wilcoxon符號秩序檢驗中,IAM模型下所有群體均極顯著(P＜0.01)偏離突變-漂移平衡; TPM 模型下,長江野生群體顯著偏離平衡(P＜0.05),黃河養(yǎng)殖群體極顯著偏離平衡(P＜0.01),其余各群體則處在突變-漂移平衡中; SMM 模型下,長江野生和遼河養(yǎng)殖群體顯著偏離平衡(P＜0.05),遼河野生群體極顯著偏離平衡(P＜0.01),其余群體未偏離突變-漂變平衡。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究預熱次數(shù)設為10000,預設聚類數(shù)值(K值)為2—10個,每個K值下重復運算5次,結(jié)果發(fā)現(xiàn)每個K值下差異不大,說明運算長度符合要求。根據(jù)K值對應的相關參數(shù)的趨勢,未發(fā)現(xiàn)明顯的折點,未能成功劃分6群體河蟹的理論群體數(shù)。圖4為在K=2、3、4時的遺傳結(jié)構(gòu)圖,圖中各種顏色分布相互混亂,不能聚成相對獨立的群體,這暗示三水系6群體河蟹的遺傳組成混雜嚴重,遺傳分化不明顯。

表5 河蟹29個微衛(wèi)星位點的瓶頸效應分析Tab.5 Results of Botlleneck analysis of the 29 microsatellite loci in the 6 populations of E. sinensis

表6 河蟹6群體突變-漂移平衡分析Tab.6 Results of mutation-drift equilibrium tests of the 6 populations of E. sinensis

圖4 河蟹群體在不同假設K值下的遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig.4 STRUCTURE genetic cluster analysis for the six populations of E. sinensis

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

本研究篩選了中華絨螯蟹 29個的微衛(wèi)星位點,在360只個體DNA樣本中進行擴增,并利用高分辨率的熒光標記毛細管電泳技術(shù)進行等位基因分型,從研究結(jié)果看,本研究中29個SSR位點的平均等位基因數(shù)(Na=32.5170)和平均多態(tài)信息含量(PIC=0.864)多高于先前河蟹種群 SSR遺傳分析的研究報道(Changet al,2008; Suiet al,2009; 熊良偉等,2012;唐劉秀等,2013),除位點Esin87外,其余位點均為高多態(tài)性位點。本研究每個群體選擇樣本數(shù) 60個,多于其上述研究樣本數(shù)量(28—40個),在一定范圍之內(nèi),樣本量的大小與所觀測到的不同基因座等位基因檢出數(shù)量之間存在正相關關系(高雅等,2008)。整體上,對相同群體和相同 SSR位點而言,本研究中等位基因數(shù)量、期望雜合度和觀測雜合度在大多數(shù)位點高于先前報道(H?nflinget al,2003; Changet al,2006; 唐劉秀等,2013),這可能與樣品數(shù)量和檢測技術(shù)不同有關。通常大樣本量和毛細管電泳分型技術(shù)能夠提供更可靠的遺傳多樣性信息(劉皓等,2015)。由此可見,本研究選用的 SSR位點、樣本量和毛細管電泳分型技術(shù),可以較全面地反映各水系河蟹的遺傳多樣性信息,能夠有效評估其群體遺傳特性。

本研究中 6個群體平均期望雜合度均較高(He=0.870—0.881),顯示本研究中野生和養(yǎng)殖河蟹群體均具有較高的遺傳多樣性水平,這與先前對我國幾個野生群體(Suiet al,2009)和養(yǎng)殖群體(朱澤遠等,2007; 熊良偉等,2012)的研究結(jié)果相似。就野生群體而言,香農(nóng)信息指數(shù)反映的遺傳多樣性依次為: 長江野生＞黃河野生＞遼河野生。遺傳多樣性水平由南向北依次降低,這種地理差異往往和生長環(huán)境有關,長江水系流域面積廣,與干流相通的河道與湖泊多,適宜河蟹生長和育肥,因而種群數(shù)量較大,相比之下,黃河及遼河水系由于所處緯度較高,水溫較低,流域面積相對較小,因此種群規(guī)模相對較小。3個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性依次為: 長江養(yǎng)殖＞遼河養(yǎng)殖＞黃河養(yǎng)殖,本研究中長江和遼河水系養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性情況與熊良偉等(2012)研究結(jié)果基本一致,黃河養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于長江和遼河養(yǎng)殖群體,這可能是由于黃河流域河蟹養(yǎng)殖規(guī)模相對較小,其人工繁殖的基礎群體親本數(shù)量較少,經(jīng)過多代人工繁殖后導致其遺傳多樣性進一步下降(熊良偉等,2012)。

從等位基因數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)看,本研究中長江和黃河的養(yǎng)殖群體略低于相應的野生群體,這與熊良偉等(2012)的研究結(jié)果相似,究其原因可能是兩個養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量較少造成的始祖效應(founder effect),后續(xù)傳代育苗過程中主要通過表型選擇親本,容易增加近交幾率,類似的情況已經(jīng)在大西洋鮭(Salmon salar)中被證實(Skaalaet al,2004)。遼河養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)高于遼河野生群體,可能有兩方面的原因。其一,由于遼河水系面積相對較小,其野生河蟹群體數(shù)量遠小于長江水系和黃河水系,加之由于過渡捕撈、環(huán)境污染和洄游通道被水閘阻擋等原因,其野生群體經(jīng)歷過有效種群下降,導致其遺傳多樣性較低(王武等,2013);其二,由于長江水系河蟹規(guī)格較大,長江水系河蟹曾經(jīng)被引入遼河流域進行池塘養(yǎng)殖,因此遼河水系養(yǎng)殖群體亦或曾受到長江群體的影響,導致種質(zhì)混雜,其遺傳多樣性偏高(王武等,2007)。

3.2 群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究中 6個群體的河蟹種群的遺傳距離(DA)與地理距離呈現(xiàn)一定的相關性,但并不完全吻合。如果沒有發(fā)現(xiàn)不同地理種群間的遺傳分化,基因流常被作為“默認”的解釋(Suiet al,2009)。有研究者基于微衛(wèi)星標記的瓶頸效應和基因流動分析研究歐亞多刺水蚤(Bythotrephes longimanus)入侵的報道提出,迅速蔓延的多產(chǎn)物種有可能獲得來自多個種群的基因流,而導致其群體遺傳分化較低(Colauttiet al,2005)。本研究天然地理種群結(jié)合地理相關養(yǎng)殖群體,能對地理種群間天然的基因流和因養(yǎng)殖活動中跨區(qū)域引種和養(yǎng)殖群體逃逸產(chǎn)生的基因流動作出側(cè)面的反映。從基于遺傳距離的聚類分析結(jié)果來看,相對其它水系而言,遼河水系的野生與養(yǎng)殖群體組成了一個較為封閉的地理種群單位,而長江、黃河養(yǎng)殖及野生群體可能因跨地域相互引種而導致有一定程度的混雜。李曉暉等(2010)對河蟹長江水系野生群體和幾個養(yǎng)殖群體進行分析后,發(fā)現(xiàn)射陽地區(qū)養(yǎng)殖群體遺傳多樣性指數(shù)高于其它幾個群體,同樣認為是不同水系河蟹種質(zhì)混雜的結(jié)果。

群體的遺傳分化值數(shù)(FST)能揭示種群間的遺傳分化程度,FST值在0—0.05之間,群體的遺傳分化較弱;FST值在 0.05—0.15之間時,遺傳分化水平中等,FST值大于 0.15時,遺傳分化較大(Ballouxet al,2002)。本研究的幾個群體間的FST值在 0.0008—0.0050之間,遠小于 0.05,遺傳分化水平微弱,這與我國6個水系的11個野生群體的微衛(wèi)星遺傳多樣性研究結(jié)果基本吻合(FST=0.0001—0.0400) (Suiet al,2009)。而在中國沿海 5個三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)地理種群中FST值為 0.0548—0.1083(李曉萍,2010),日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的幾個中國地理種群中,該值達0.0542—0.1559 (Yanget al,2010),克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的長江下游幾個地理種群中,該值亦高達0.0405—0.1559 (王長忠等,2009),日本對蝦(Marsupenaeus japonicas)野生和人工養(yǎng)殖種群的FST值略低為0.023(Luanet al,2006),這幾種重要經(jīng)濟甲殼動物地理種群的遺傳分化均高于河蟹。Brown等(1989)認為異交物種 90%以上的遺傳變異來自群體內(nèi)部,本研究中分子方差分析結(jié)果顯示,群體之間的變異僅占變異總數(shù)的 0.10%,部分變異來源于群體內(nèi)個體間(14.02%),絕大部分變異來自個體內(nèi)部(85.88%),表明河蟹群體變異程度較低。與其它甲殼動物相比,河蟹具有復雜的生活史和開放的生命周期,長距離江海洄游習性使其面臨多種差異較大的生境。由此,與其它甲殼動物相比,推測河蟹更容易因某些等位基因的丟失造成生命周期中某個環(huán)節(jié)的環(huán)境適應能力減弱或喪失,進而導致變異個體死亡或不能成功繁殖,而表現(xiàn)出較強的遺傳保守性。

3.3 群體動態(tài)分析

6個種群的瓶頸分析結(jié)果中,在 3種模型下,均有部分位點呈現(xiàn)出He與Heq的顯著或極顯著差異,在符號檢驗和Wilcoxon符號秩序檢驗中,IAM模型下,顯示幾個群體近期經(jīng)歷了不同程度的瓶頸效應,SMM 模型下,除了黃河養(yǎng)殖群體外,其余 5個群體均存在瓶頸效應。朱澤遠等(2007)在研究中發(fā)現(xiàn)幾個河蟹養(yǎng)殖群體均存在瓶頸效應,王中清等(2013)在2004、2006、2007和2011年長江野生群體中亦發(fā)現(xiàn)瓶頸效應,結(jié)合上述研究,表明中國大陸河蟹種群正面臨著持續(xù)的種質(zhì)衰退。遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,本研究的河蟹野生群體和養(yǎng)殖群體基因混雜現(xiàn)象嚴重,這一結(jié)果與徐燦(2007)的觀點相符,其研究認為自1982年起,中國大陸多個水系的河蟹便開始通過養(yǎng)殖活動中的無序引種和增殖放流交互混雜。

本研究中29個微衛(wèi)星位點中,有24個位點偏離Hardy-Weinberg平衡,觀測雜合度小于期望雜合度。Hardy-Weinberg平衡的偏離可能由多種原因?qū)е?如非隨機交配、選擇、突變、無效等位基因等,這樣就會造成群體內(nèi)存在的等位基因的丟失,純合子增加,種群的遺傳多樣性降低,從而增加近交衰退的幾率(楊銳等,2000)。當群體內(nèi)觀測雜合度小于期望雜合度,同時FIS為正值,則表示群體內(nèi)近交程度較為嚴重(Frankham,2010),本研究的28個位點的FIS均為正值,說明三水系的河蟹野生和養(yǎng)殖群體內(nèi)近交程度嚴重,存在種質(zhì)衰退的風險。先前研究表明,長江野生扣蟹的養(yǎng)殖性能優(yōu)于多年家養(yǎng)的池塘群體(Heet al,2014),這也暗示了長江水系養(yǎng)殖群體種質(zhì)退化嚴重,遺傳多樣性較低。

綜上,6個種群遺傳多樣性較高,但存在明顯的種質(zhì)混雜和群內(nèi)近交,加之瓶頸效應的造成的影響,這可能使其優(yōu)異種質(zhì)退化,不利于河蟹種質(zhì)資源的保護和開發(fā)利用,因此需要制訂科學的野生種質(zhì)保護方案和良種選育策略。對河蟹野生群體進行保護,在進行水利工程時應充分考慮對河蟹洄游的影響,天然水域增殖放流應保證苗種來源于相應的水系,從而避免種質(zhì)混雜。對河蟹進行良種選育,應盡量擴大有效有效群體數(shù)量,降低近交衰退幾率,進一步采取家系選育技術(shù),篩選與表型相關的分子標記進行多性狀復合育種提高選育效率。本研究為河蟹種質(zhì)資源評價、良種選育和分子標記開發(fā)提供了重要的基礎資料。

致謝上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院邱高峰教授提供部分微衛(wèi)星引物,傅建軍博士后在數(shù)據(jù)分析和論文寫作過程給予熱情指導,謹致謝忱。

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