歲姍姍，周　祥，周　楷

(海南大學(xué) 環(huán)植學(xué)院，海南 ?？?570228)

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正交試驗(yàn)法優(yōu)化黃粉蟲(chóng)甲殼素提取新工藝

歲姍姍，周祥，周楷

(海南大學(xué) 環(huán)植學(xué)院，海南 海口 570228)

摘要：以黃粉蟲(chóng)為原料，用酶水解蛋白質(zhì)，有機(jī)酸去除灰分，提取甲殼素.通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)酶水解條件和有機(jī)酸處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明：酶水解最佳的處理為胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按1∶1組合、酶用量為1.0%、水解時(shí)間為7 h,水解溫度為55 ℃；有機(jī)酸最佳的組合為蘋(píng)果酸處理組合，其酸濃度為15%，處理時(shí)間為10 h,固液比為1∶50 (g·mL-1).在此條件下所得到的甲殼素，其蛋白質(zhì)含量為3.39%，灰分含量為0.35%.

關(guān)鍵詞：甲殼素； 蛋白酶； 有機(jī)酸； 正交試驗(yàn)

甲殼素又稱殼多糖,是自然界中僅次于纖維素的第二大生物資源，被認(rèn)為是繼蛋白質(zhì)、糖、脂肪、纖維素、礦物質(zhì)之后的“第六生命要素”[1-2].目前，甲殼素及其衍生物在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、功能材料的制作、農(nóng)林業(yè)、輕紡工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景[3-4].

用于制備甲殼素的原料主要是蝦、蟹殼，但是近年來(lái)，隨著昆蟲(chóng)資源的大量開(kāi)發(fā)，利用昆蟲(chóng)生產(chǎn)甲殼素已經(jīng)成為熱點(diǎn).王穩(wěn)航等人利用鹽場(chǎng)廢棄物鹵蠅蛆殼提取了甲殼素和殼聚糖[5].曹小紅等人在利用蠅蛆提取甲殼素中確定了酸法脫灰分，堿法除蛋白質(zhì)和脂肪的最佳工藝條件[6].詹永樂(lè)等人優(yōu)化了利用蠶蛹皮制取甲殼素的工藝條件[7].王敦等人以金龜子為材料對(duì)甲殼素的提取進(jìn)行了研究[8].另外，以松毛蟲(chóng)、螞蟻、蟬等蟲(chóng)類為材料來(lái)提取甲殼素的報(bào)道已有不少.由于昆蟲(chóng)中鈣物質(zhì)的含量低，而甲殼素的含量卻比蝦蟹高出 5% ～10%,因此從昆蟲(chóng)中比從蝦、蟹殼中可得到較多的甲殼素[9].在當(dāng)前我國(guó)殼聚糖資源十分短缺的情況下，開(kāi)發(fā)昆蟲(chóng)甲殼素資源無(wú)疑具有十分重要的意義.黃粉蟲(chóng)是一種倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)，在室內(nèi)容易飼養(yǎng)，其繁殖速度快、生產(chǎn)周期短、投資少[10].目前，以黃粉蟲(chóng)為原料來(lái)生產(chǎn)飼料添加劑、保健食品、營(yíng)養(yǎng)液、焙烤食品的研究己取得了一些進(jìn)展，然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃粉蟲(chóng)資源的開(kāi)發(fā)多集中在對(duì)其蛋白質(zhì)資源的利用上，而在黃粉蟲(chóng)甲殼素資源的開(kāi)發(fā)利用方面還處于研究階段，但是隨著近年來(lái)黃粉蟲(chóng)產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，以黃粉蟲(chóng)作為甲殼素的提取原材料具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值.

目前，提取甲殼素最常用的方法是傳統(tǒng)的酸堿法[11].其中，最核心的部分是利用強(qiáng)酸浸泡去除灰分和利用強(qiáng)堿浸泡去除蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，但此法的酸堿耗量大、能耗高，且會(huì)產(chǎn)生大量的酸堿廢液.近年來(lái)人們嘗試對(duì)傳統(tǒng)酸堿法做了很多改進(jìn)，并取得了一定效果，如有機(jī)酸法、蛋白酶法、微生物發(fā)酵[12]等.鑒此，本試驗(yàn)利用黃粉蟲(chóng)資源，用酶水解蛋白質(zhì)、以有機(jī)酸去除灰分來(lái)提取甲殼素，并按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，旨在尋找以有機(jī)酸結(jié)合蛋白酶來(lái)提取黃粉蟲(chóng)甲殼素的最佳工藝條件，在不污染環(huán)境的前提下，為黃粉蟲(chóng)資源的綜合利用提供基礎(chǔ)的研究資料.利用有機(jī)酸結(jié)合蛋白酶法提取甲殼素不僅能避免傳統(tǒng)酸堿法提取過(guò)程中因大量酸堿廢棄液而造成的環(huán)境污染，而且還能將脫蛋白后的酶解液制成氨基氮(作為海鮮調(diào)味品)，回收有機(jī)酸鈣，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用.

1材料與方法

1.1材料原料：黃粉蟲(chóng)(TenebriomolitorLinnaeus)，常溫下飼養(yǎng)，主要喂食麥麩，定期收集.

試劑：石油醚(沸程60～90 ℃)(廣州化學(xué)試劑廠)；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(上海佳和生物科技有限公司)；醋酸檸、檬酸、蘋(píng)果酸(食品級(jí))；鹽酸(分析純)；硫酸鉀、硫酸銅、硼酸、硫酸(分析純)；蒸餾水.

儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(BS-600L型 ，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；電子萬(wàn)用爐(220 V,1 000 w,天津市泰斯特儀器有限公司)；電阻爐(220 V,1 500 w，上海-恒科學(xué)儀器有限公司)；80-2B臺(tái)式離心機(jī)；凱氏定氮裝置；

1.2方法 收集黃粉蟲(chóng)，烘干，研碎，按1∶12的比例加入石油醚，60 ℃恒溫水浴，制得脫脂蟲(chóng)粉后，選擇幾種最適溫度為50～60 ℃范圍內(nèi)的酶[13]作為酶制劑，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合酶(胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶1)等，以酶制劑、酶用量、水解時(shí)間、水解溫度為自變量，并以殘余蛋白含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)蛋白質(zhì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化.以(檸檬酸、蘋(píng)果酸、酸醋)有機(jī)酸、酸濃度、處理時(shí)間、固液比為自變量，以殘余灰分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)去灰分條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到黃粉蟲(chóng)甲殼素提取的最佳工藝條件.

殘余蛋白的測(cè)定：采用凱氏定氮法[14]，計(jì)算公式為:

式中,X為樣品中蛋白質(zhì)的含量(%)；C為標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的濃度(mol·L-1)；V1為滴定樣品消耗的鹽酸量(mL)；V2為滴定空白消耗的鹽酸量(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)；

殘余灰分的測(cè)定：參照衛(wèi)生部GB/T5009.4—2010的方法[15]以及550 ℃灼燒法[16].計(jì)算公式為：灰分=[(Wt-W0)/(W-W0)]×100% ,式中，W0為空坩堝質(zhì)量(g)；Wt為灰化后坩堝+灰分的質(zhì)量(g)；W為空坩堝+樣品的質(zhì)量(g).

數(shù)據(jù)處理：利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，Sig值小于0.05被認(rèn)為因素之間有顯著性差異，Sig值小于0.01被認(rèn)為差異是極顯著的.

2結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)水解正交試驗(yàn)的結(jié)果分析

表1　蛋白質(zhì)水解正交試驗(yàn)結(jié)果

表2　方差分析表

R方 = .927(調(diào)整R方 = .895)

蛋白質(zhì)水解正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，在蛋白質(zhì)水解L9(34) 正交試驗(yàn)中，殘余蛋白質(zhì)含量為水解程度指標(biāo)，通過(guò)比較k值可以看出，A3、B2、C2、D3為各因素水平最優(yōu).

表中R值反應(yīng)各因素的主次，在表1中因素D的極差最大，說(shuō)明水解溫度為影響蛋白質(zhì)水解的主要因素，其次是酶用量和酶制劑，處理時(shí)間是影響最小的因素.

從方差分析表2可以知道，在試驗(yàn)中A、B、C、D4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響均顯著，Sig值小于0.05，其中A、B、D3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響是極顯著的(Sig值小于0.01).比較F值可以得出，因素的主次順序依次是D>B>A>C,與極差分析基本吻合.

經(jīng)綜合極差與方差分析確定，蛋白質(zhì)水解的最優(yōu)組合為D3B2A3C2，即胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按1∶1組合、酶用量為1.0%、水解時(shí)間為7h,水解溫度為55 ℃.

2.2有機(jī)酸去除灰分的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3　有機(jī)酸去灰分的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析表

R方 = .967(調(diào)整R方 = .952)

有機(jī)酸去除灰分正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，通過(guò)比較k值可以確定，各因素的最優(yōu)水平為A2、B2、C2、D3，從表3中的R值可以判斷，各因素中，去除灰分的效果順序依次是B>C>D>A，即酸濃度>處理時(shí)間>固液比>有機(jī)酸，由此可見(jiàn)，酸濃度對(duì)去除灰分的影響最大，其次是處理時(shí)間、固液比，而有機(jī)酸對(duì)去除灰分的影響最小.從表4的方差分析中可以看出，在去除灰分的正交試驗(yàn)中，4個(gè)因素對(duì)去除效果的影響均是極顯著的Sig值皆小于0.01.綜合表3和表4可以得出，去除灰分的最佳處理組合為B2C2D3A2，即蘋(píng)果酸處理，酸濃度為15%，處理時(shí)間為10 h,固液比為1∶50.

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)蛋白質(zhì)水解的最優(yōu)組合：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按 1∶1組合、酶用量為1.0%、水解時(shí)間為7 h、水解溫度為55 ℃；去灰分的最佳組合：用蘋(píng)果酸處理，酸濃度為15%，處理時(shí)間為10 h,固液比為1∶50.為了檢驗(yàn)甲殼素中殘余蛋白質(zhì)與殘余灰分的含量，在上述最優(yōu)條件下，重復(fù)3次提取，甲殼素測(cè)定結(jié)果如表5所示，最終得到的甲殼素蛋白質(zhì)含量為3.39%，灰分含量為0.35%.

表5　正交試驗(yàn)結(jié)果的檢驗(yàn)

3小結(jié)與討論

本試驗(yàn)主要針對(duì)黃粉蟲(chóng)甲殼素提取過(guò)程中的兩個(gè)主要階段的多個(gè)影響因素，設(shè)置了4因素3水平的正交試驗(yàn)，選擇L9(34)正交表，由于正交表各列因素已經(jīng)排滿，為了減小誤差，在同一處理上重復(fù)了3次試驗(yàn)，增加了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度，得出酶水解最佳的處理組合為：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按1∶1組合、酶用量為1.0%、水解時(shí)間為7 h、水解溫度為55 ℃，在4個(gè)影響因素中水解溫度是影響蛋白質(zhì)水解的主要因素，其次是酶用量、酶制劑，處理時(shí)間是影響最小的因素.有機(jī)酸處理組合為：蘋(píng)果酸、酸濃度為15%、處理時(shí)間為10 h、固液比為1∶50.其中，酸濃度對(duì)灰分的去除影響最大，其次是處理時(shí)間、固液比，有機(jī)酸的影響最小.通過(guò)檢驗(yàn)在此最佳提取條件下所得到甲殼素，其蛋白質(zhì)含量為3.39%，灰分含量為0.35%.

甲殼素的提取大多采用傳統(tǒng)酸堿法，即以強(qiáng)堿去蛋白質(zhì)，以強(qiáng)酸去除灰分，雖然采用傳統(tǒng)的酸堿法來(lái)提取甲殼素，其成本低，且工藝簡(jiǎn)單，但該法所耗的酸量較大、能耗較高，而且會(huì)產(chǎn)生大量的酸堿廢棄液，并且在強(qiáng)酸條件下甲殼素容易降解.近年來(lái)，對(duì)傳統(tǒng)法的改進(jìn)層出不窮，如有微生物發(fā)酵法，此法的反應(yīng)條件溫和，能改善傳統(tǒng)方法中的一些弊端，所得到的甲殼素分子量亦較高，且蛋白質(zhì)等成分也能回收利用，但此法耗時(shí)較長(zhǎng)，需要發(fā)酵罐等設(shè)備，工藝亦較為復(fù)雜，此外，此法還處于研究階段.而本試驗(yàn)采用有機(jī)酸結(jié)合蛋白酶法來(lái)提取甲殼素，其工藝簡(jiǎn)單，不僅能在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)，而且能回收酶解液中的蛋白質(zhì)等成分，解決了環(huán)境污染問(wèn)題，此外，該法避免了因有機(jī)酸的酸性較低而致使甲殼素不易發(fā)生水解的問(wèn)題，可得到高分子量的甲殼素，并且能獲得高品質(zhì)的甲殼素，可使甲殼素中殘余灰分的含量小于1%.本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)方差分析確定了酶水解去除灰分的最佳條件，并且進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，最終獲得了有機(jī)酸結(jié)合蛋白酶法提取黃粉蟲(chóng)甲殼素的最佳工藝條件，這為今后大規(guī)模地生產(chǎn)甲殼素提供了理論依據(jù)以及技術(shù)參考.

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Optimization of the New Extraction Technology of Chitin fromTenebriomolitorby Orthogonal Test

Sui Shanshan, Zhou Xiang, Zhou Kai

(College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228，China)

Abstract：In the report, the technique of protein hydrolyzed with protease was used to extract the chitin from theTenebriomolitor, and organic acid was used to remove ash, and the orthogonal test was performed to optimize the condition of enzymatic hydrolysis and organic acid treatment. The results showed that the best condition of enzymatic hydrolysis was trypsin and papain (1∶1), enzyme dosage was 1.0%, hydrolysis time was 7 h, hydrolysis temperature was 55 ℃; The best condition of organic acid treatment was malic acid, the concentration of acid was 15%, the time was 10h, the ratio of solid to liquid was 1∶50 (g/mL); under such conditions, the protein would be 3.39% and the ash would be 0.35% in chitin.

Keywords：chitin; protease; organic acids; orthogonal test

中圖分類號(hào)：S 899.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0027

文章編號(hào)：1004-1729(2015)02-0147-05

收稿日期：------------------------ 2014-11-17基金項(xiàng)目： 海南大學(xué)與昌江?？h合作項(xiàng)目(2012825)

作者簡(jiǎn)介：歲姍姍(1988-)，女，云南大理人，2012級(jí)碩士研究生，研究方向：資源昆蟲(chóng)―黃粉蟲(chóng)資源的綜合利用.通信作者： 周祥(1968-)，男，海南?？谌耍苯淌?，研究方向：森林昆蟲(chóng)及害蟲(chóng)防治，E-mail：zhouxiangdc@yahoo.com.cn