白紅娟，王　珊，柴春鏡，牛偉平

(1. 中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原030051；2. 北京航天計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究所，北京100076；

3. 中北大學(xué)朔州校區(qū)化工與環(huán)境學(xué)院，山西朔州036000；4. 山西省農(nóng)藥檢定所，山西太原030001)

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球形紅細(xì)菌降解RDX的動(dòng)力學(xué)及其機(jī)理研究

白紅娟1，王珊2，柴春鏡3，牛偉平4

(1. 中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原030051；2. 北京航天計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究所，北京100076；

3. 中北大學(xué)朔州校區(qū)化工與環(huán)境學(xué)院，山西朔州036000；4. 山西省農(nóng)藥檢定所，山西太原030001)

摘要：為了探索球形紅細(xì)菌對(duì)黑索今(RDX)的降解動(dòng)力學(xué)及機(jī)理，研究了該菌株生長(zhǎng)與降解RDX的關(guān)系，并對(duì)降解的動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行了擬合分析。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析了該菌株降解RDX的中間代謝產(chǎn)物，并推測(cè)了其可能的降解途徑。結(jié)果表明，RDX質(zhì)量濃度為2.5~30mg/L時(shí)，該菌株對(duì)RDX的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。培養(yǎng)4d時(shí)，用GC-MS檢測(cè)到兩種中間產(chǎn)物：六氫-1-亞硝基-3,5-二硝基-1,3,5-三嗪(MNX)和次甲基二硝胺(MEDINA)，其母離子的質(zhì)荷比(m/z)分別為207和135，其可能的降解途徑為：RDX首先還原為MNX，再進(jìn)行一系列還原反應(yīng)生成產(chǎn)物MEDINA，最終降解為小分子物質(zhì)，并認(rèn)為硝基還原酶為該降解過(guò)程中的重要酶。

關(guān)鍵詞：球形紅細(xì)菌；光合細(xì)菌；黑索今；RDX；降解動(dòng)力學(xué)；降解機(jī)理；MNX；MEDINA

引言

黑索今(RDX)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，因其具有顯著的生物毒性，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署已將其列入優(yōu)先控制污染物名單[1]。國(guó)內(nèi)外處理RDX毒性的常用方法有光催化、吸附、超臨界水氧化以及微生物處理等[2-4]。物理化學(xué)方法一般僅適于濃度較高的有機(jī)廢水處理，對(duì)濃度較低的有機(jī)廢水處理效果差且成本高。生物降解具有成本低廉、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。盡管許多研究[5-10]表明RDX能被微生物降解，但其代謝途徑卻各不相同。Eaton H L等[6]用LC-MS/MS(APCI-)檢測(cè)到RDX的代謝產(chǎn)物六氫-1,3-二亞硝基-5-硝基-1,3,5三嗪(DNX)和六氫-1,3,5-三亞硝基-1,3,5三嗪(TNX)，但未檢測(cè)到次甲基二硝胺。Chen Yong等[9]用LC-MS/MS(APCI-)檢測(cè)到RDX的代謝產(chǎn)物MNX、二羥胺-硝基-1,3,5-三嗪和羥胺-二硝基-1,3,5-三嗪，但未檢測(cè)到DNX和TNX。Zhao J S等[10]用HPLC/UV分析了雙酶桿菌HAW-1代謝RDX的中間產(chǎn)物MNX、DNX和TNX。

光合細(xì)菌能在厭氧光照條件下進(jìn)行不放氧光合作用，特別是紫色非硫細(xì)菌不僅能在厭氧光照的條件下進(jìn)行光能異養(yǎng)生長(zhǎng)，而且能在好氧黑暗條件下進(jìn)行好氣異養(yǎng)生長(zhǎng)。光合細(xì)菌這種隨著生存環(huán)境而靈活改變代謝類型的特性，較其他微生物材料具有優(yōu)越性[11]。本研究采用球形紅細(xì)菌降解RDX，探討了RDX的厭氧降解動(dòng)力學(xué)和降解途徑，為該菌株在雜氮化合物廢水污染治理中的應(yīng)用提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料和儀器

菌種：球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides) H菌株系紫色非硫菌群紅細(xì)菌屬光合細(xì)菌, 由山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室分離、鑒定并保存[11]；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(酵母膏 1.0g、MgSO40.2g、CaCl20.07g、(NH4)2SO41.25g、蘋果酸 2.5g、KH2PO40.6g、K2HPO40.9g、蒸餾水1000mL, pH值7.0)；馴化培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基加適量RDX)。

日本日立公司CXTH-3000型高效液相色譜儀，分離柱為 HYPERHILBDH C18柱 (4.6mm×250mm, 5μm)，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)235nm，流動(dòng)相為甲醇/水(體積比為50∶50)，流速 1.0mL/min, 進(jìn)樣量10μL；美國(guó)Agilent公司HP5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，柱溫為80℃，以10℃/min升溫至280℃，恒溫2min，進(jìn)樣口溫度為250℃，色譜-質(zhì)譜接口溫度為280℃，電子能量70eV，掃描范圍50~500m/z，選擇離子全掃描法，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1.0mL/min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的馴化

將體積分?jǐn)?shù)10%的原始菌液接入RDX質(zhì)量濃度為20mg/L的馴化培養(yǎng)基, 在30℃、2500 Lux光照度的培養(yǎng)箱中厭氧馴化培養(yǎng)4d作為馴化菌種。

1.2.2RDX降解培養(yǎng)基

將2g/L的RDX丙酮溶液過(guò)0.45μm濾膜除菌，取一定量置于滅菌的血清瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后加入滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使RDX的最終質(zhì)量濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)值。

1.2.3菌株生長(zhǎng)與RDX降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

在無(wú)菌條件下, 將一定量馴化后的菌懸液在10000r/min下離心10min, 棄上清液，菌體用磷酸緩沖液洗滌2次后，用培養(yǎng)基制備成菌懸液備用。在RDX 質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、30 和40mg/L的降解培養(yǎng)基中，接種一定量的菌懸液(OD值為0.123)，分別調(diào)節(jié)pH值至6.5~ 7.0，在溫度30℃、厭氧光照條件(血清瓶裝滿培養(yǎng)物, 蓋橡皮塞；光照度為2500 Lux, 靜置)培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7d后以10000r/min離心菌體10min，測(cè)定上清液中剩余RDX的質(zhì)量濃度，考察菌種對(duì)不同質(zhì)量濃度RDX的降解動(dòng)力學(xué)。用等量蒸餾水制備的菌懸液，于波長(zhǎng)680nm處測(cè)定OD值，以測(cè)定其生物量。同時(shí)，用不加菌體和接種滅活的死菌體的樣品作對(duì)照，每個(gè)條件做2個(gè)平行樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4降解RDX菌株粗酶液的制備

參考文獻(xiàn)[13]制備粗酶液。將已培養(yǎng)好的菌液以10000r/min離心10min，棄上清液，菌體用0.1mol/L、pH值7.5的磷酸緩沖溶液洗滌2次，懸浮于1mL的磷酸緩沖溶液中，然后樣品在冰浴中用頻率50Hz超聲波破碎10次(每次間隔30s超聲10s)，細(xì)胞破碎液于4℃再以12000r/min離心10min，棄沉淀，上清液即為粗酶液。

1.3測(cè)試方法

用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)680nm 處測(cè)定菌液濃度。

用高效液相色譜法測(cè)定RDX的質(zhì)量濃度。20mg/L的RDX經(jīng)球形紅細(xì)菌降解4d后取樣，經(jīng)過(guò)高速離心(10000r/min，10min)后收集上清液，經(jīng)0.2μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，用2g無(wú)水Na2SO4干燥，在35℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，甲醇定容至2mL細(xì)胞瓶，用GC-MS進(jìn)樣分析。

用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定粗酶液中總蛋白質(zhì)含量[14]。硝基還原酶活性的測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]，反應(yīng)混合物包括：6.5~8.5mg 蛋白/mL，20mmol/L 磷酸緩沖溶液(pH值7.4)，0.09mmol/L RDX (二甲基甲酰胺溶劑，體積分?jǐn)?shù)2%)，0.5mmol/L NADPH。混合物在37℃下反應(yīng)4h, 然后放置于冰浴，并加入1mL ZnSO4(質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%)終止反應(yīng)。反應(yīng)后的混合物中加入1.0g NaCl和4.0mL乙酸乙酯萃取殘留的RDX，濃縮有機(jī)層，用0.5mL甲醇定容。以每分鐘消耗1μmol RDX所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

2結(jié)果與討論

2.1H菌株生長(zhǎng)與降解RDX的關(guān)系

球形紅細(xì)菌H菌株在RDX(初始質(zhì)量濃度為20mg/L)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及其與RDX降解的關(guān)系見(jiàn)圖1。

圖1　降解時(shí)間與細(xì)菌生長(zhǎng)量及RDX質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線Fig.1　The relation curves between the growth ofRhodobacter sphaeroides, the mass concentration of RDXand RDX degradation time

從圖1可以看出，當(dāng)降解2d時(shí)，RDX質(zhì)量濃度為12.9mg/L，RDX的去除率為32.8%；當(dāng)降解4d 時(shí)，RDX質(zhì)量濃度迅速降低為4.2mg/L，去除率達(dá)到78.0%；當(dāng)降解5d 時(shí)，RDX質(zhì)量濃度明顯降低為2.2mg/L，去除率達(dá)到88.6%。可見(jiàn)菌株的生長(zhǎng)曲線與RDX的降解曲線具有一定的一致性，隨著菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3~5d) ，RDX的降解效率顯著升高;之后隨著時(shí)間的增加，由于營(yíng)養(yǎng)成分的缺失和代謝物的增加，菌株生長(zhǎng)逐漸至衰退期，對(duì)RDX的降解能力也隨之下降，降解曲線趨于平緩。當(dāng)降解7d時(shí)，用降解菌降解RDX(初始質(zhì)量濃度為20mg/L)培養(yǎng)液，未檢測(cè)到RDX；而不加菌的空白對(duì)照液中，RDX的7d自然降解率僅為3.1%，接種死菌體對(duì)照液中，RDX的7d吸附率僅為2.3%，表明RDX的降解過(guò)程是生物酶的作用過(guò)程。因此，菌體降解RDX與菌體的生長(zhǎng)指數(shù)期有關(guān)。

2.2H菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度RDX的降解動(dòng)力學(xué)

將降解試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一級(jí)動(dòng)力學(xué)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬，見(jiàn)式(1)和式(2)：

C=C0e-k1t

(1)

1/C=1/C0+k2t

(2)

式中：k1為一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)，d-1；k2為二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)，L/(mg·d)；t為反應(yīng)時(shí)間，h;C、C0分別為t時(shí)間和初始時(shí)的底物濃度，mg/L。

H菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度RDX降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。由表1可看出本試驗(yàn)條件下的模擬結(jié)果，降解動(dòng)力學(xué)在一定程度上較符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征；RDX質(zhì)量濃度為2.5~30.0mg/L時(shí)，k1較大，半衰期t1/2較短，均小于2.5d；RDX質(zhì)量濃度為5.0mg/L時(shí)，k1最大，t1/2僅為1.3d；RDX質(zhì)量濃度為30.0mg/L時(shí)，k1降低，t1/2增至2.2d；RDX質(zhì)量濃度為40.0mg/L時(shí)，降解效果出現(xiàn)明顯下降，k1迅速降至0.092d-1。結(jié)果也表明，在RDX的生物降解過(guò)程中，RDX既是反應(yīng)的基質(zhì)，同時(shí)也是抑制劑。

表1　H菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度RDX降解的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：ρ(RDX)為RDX的初始質(zhì)量濃度；k1為一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)；k2為二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)；t1/2為半衰期；R2為相關(guān)系數(shù)。

2.3H菌株降解RDX的中間產(chǎn)物及途徑分析

2.3.1中間產(chǎn)物的GC-MS分析

為探討H菌株對(duì)RDX的降解動(dòng)態(tài)過(guò)程及其降解產(chǎn)物，在降解反應(yīng)完成后，將其體系中各組分用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。研究結(jié)果表明, 隨著降解的進(jìn)行，各種物質(zhì)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，底物及各種不同中間產(chǎn)物均表現(xiàn)出有序的產(chǎn)生和消失規(guī)律。從圖2可以看出，物質(zhì)A的出峰時(shí)間為16.1min，當(dāng)其被H菌株降解3d后, 其峰高比未降解處理的峰高降低了大約60%，同時(shí)出現(xiàn)了1個(gè)較大的峰(出峰時(shí)間13.2min)和1個(gè)小峰(出峰時(shí)間4.3min)，形成的主要中間產(chǎn)物B和C；當(dāng)降解4d時(shí)，物質(zhì)A的峰高比未降解處理時(shí)明顯降低了78%，中間產(chǎn)物B和C的峰高比降解3d分別降低了40%和24%；當(dāng)降解7d時(shí), 物質(zhì)A、中間產(chǎn)物B和C的峰均已消失，表明物質(zhì)A及其中間產(chǎn)物已經(jīng)降解完全。

圖2　不同降解時(shí)間下球形紅細(xì)菌降解RDX代謝產(chǎn)物的GC-MS圖譜Fig.2　GC-MS spectra of metabolites during RDX degradationby Rhodobacter sphaeroides with different degradation times

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)譜圖的比對(duì)分析物質(zhì)A、中間代謝產(chǎn)物B和C的質(zhì)譜圖，其對(duì)應(yīng)母離子、離子碎片及其質(zhì)核比(m/z)見(jiàn)表2。3種主要物質(zhì)分別為RDX、六氫-1-亞硝基-3,5-二硝基-1,3,5三嗪 (MNX)和次甲基二硝胺(MEDINA)。保留時(shí)間為16.1min，母離子的m/z為223，物質(zhì)A為RDX；保留時(shí)間為13.2min，母離子的m/z為207，中間代謝產(chǎn)物B為MNX；保留時(shí)間為4.3min，母離子[MEDINA-H]+的m/z為135，中間代謝產(chǎn)物C為MEDINA。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到RDX的2種代謝中間產(chǎn)物與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的一致。

表2　球形紅細(xì)菌降解RDX代謝過(guò)程中代謝產(chǎn)物的GC-MS分析結(jié)果

2.3.2H菌株降解RDX的機(jī)理分析

為探討H菌株降解RDX的機(jī)理，通過(guò)測(cè)定微生物代謝產(chǎn)物分析其降解代謝途徑，見(jiàn)圖3。

圖3　球形紅細(xì)菌對(duì)RDX降解的厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.3　The anaerobic biotransformation pathway of RDXdegradation by Rhodobacter sphaeroides

2.4RDX質(zhì)量濃度對(duì)菌體細(xì)胞中硝基還原酶活力的影響

不同質(zhì)量濃度RDX對(duì)H菌株產(chǎn)生硝基還原酶活力的影響如表3所示。由表3可見(jiàn)，在低質(zhì)量濃度RDX的培養(yǎng)液中，H菌株產(chǎn)生的硝基還原酶比活力與對(duì)照組相比有一定程度升高；在RDX(質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0mg/L)作用下，其比活力較對(duì)照組分別增加了21.4%、41.4%、27.3%、6.5%。而隨著培養(yǎng)液中RDX質(zhì)量濃度的提高，其比活力受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)液中RDX降解質(zhì)量濃度達(dá)到30.0mg/L時(shí)，相比對(duì)照組，其比活力下降了17.9 %。

表3　RDX質(zhì)量濃度對(duì)H菌株產(chǎn)生硝基還原酶的影響

注：ρ(RDX)為RDX初始質(zhì)量濃度；m為總蛋白質(zhì)量；KA為總酶活；RKA為比活力。

3結(jié)論

(1)球形紅細(xì)菌降解RDX與菌體的生長(zhǎng)指數(shù)期有關(guān)；RDX質(zhì)量濃度為2.5~30.0mg/L時(shí)，降解動(dòng)力學(xué)較符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，半衰期均小于2.5d。

(2)在球形紅細(xì)菌降解RDX的過(guò)程中，出現(xiàn)了兩種中間產(chǎn)物MNX和MEDINA，推測(cè)其可能的降解途徑為RDX首先還原為MNX，再進(jìn)行一系列還原反應(yīng)生成產(chǎn)物MEDINA，最終礦化為小分子。

(3)硝基還原酶為該降解過(guò)程中的重要酶，RDX質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0mg/L時(shí)，其比活力比對(duì)照組分別增加了21.4%、41.4%、27.3%、6.5%；而隨著培養(yǎng)液中RDX質(zhì)量濃度提高到30.0mg/L，其比活力受到抑制。

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Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) by Rhodobacter Sphaeroides

BAI Hong-juan1, WANG Shan2, CHAI Chun-jing3, NIU Wei-ping4

(1. School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Taiyuan 030051, China；

2. Beijing Aerospace Institute for Metrology and Measurement Technology, Beijing 100076, China；

3. School of Chemical Engineering and Environment, North University of China, Shuozhou Shanxi 036000, China；

4. Institute for the Control of Agrochemicals Shanxi, Taiyuan 030001, China)

Abstract:To explore the degradation kinetics and mechanism of explosive hexahydro-1, 3, 5-trinitro-1, 3, 5-triazine (RDX) by Rhodobacter sphaeroides, the relationship between the growth of Rhodobacter sphaeroides and RDX degradation was studied, and the fitting analysis of the degradation kinetic equation of RDX was performed. The intermediates of RDX metabolized by the strain were analyzed by gas chromatograph-mass spectrometer(GC-MS), and the possible pathway of RDX degradation was deduced. The results show that the RDX degradation by the strain is in accordance with the first-order kinetic model for RDX with initial mass concentration of 2.5-30mg/L. Cultivating for 4d, two intermediates hexahydro-1-nitroso-3,5-dinitro-1,3,5-triazine (MNX) and methylenedinitramine(MEDINA) were detected by GC-MS, and the ratios of mass to charge(m/z)of its parention were 207 and 135, respectively. The possible degradation pathway is that RDX is first reduced to MNX and the latter undergoes further reduction to finally produce MEDINA, which was finally degraded to smaller molecular compounds, considering that nitro reductase is an important enzyme in the degradation process.

Keywords:Rhodobacter sphaeroides; photosynthetic bacteria; hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine; RDX; degradation kinetics; degradation mechanism; MNX; MEDINA

作者簡(jiǎn)介:白紅娟(1969-)，女，教授，從事環(huán)境微生物技術(shù)研究。

基金項(xiàng)目:山西省科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(20080311027-1)；中北大學(xué)自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助

收稿日期:2015-08-04；修回日期:2015-10-13

中圖分類號(hào)：TJ55; X93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-7812(2015)06-0051-05

DOI：10.14077/j.issn.1007-7812.2015.06.010