杜 偉，王 揚(yáng)，張曉輝，王鼎南，蔣林娟，封震靜

（浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江杭州 310023）

小鼠生物法與ELISA法檢測麻痹性貝類毒素的比較

杜 偉，王 揚(yáng)?，張曉輝，王鼎南，蔣林娟，封震靜

（浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江杭州 310023）

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是全世界分布最廣、危害最大，也是最為大眾熟知的一類赤潮藻毒素。本研究比較了小鼠生物法與酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）檢測水產(chǎn)品中PSP的效果。結(jié)果表明，樣品中PSP含量在350μg·kg－1以上時(shí)，2種檢測方法結(jié)果吻合度較好；樣品中PSP含量在40～350μg·kg－1時(shí)小鼠生物法無法檢測到樣品中PSP，而ELISA法可以快速檢測樣品中PSP；在PSP陰性樣品中兩者檢測結(jié)果一致。通過比較研究，2種方法在快速篩選PSP時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)，日常檢測工作中將2種方法適當(dāng)結(jié)合可提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確度。

麻痹性貝類毒素；小鼠生物法；酶聯(lián)免疫吸附法

赤潮（red tides）或有害藻華（harm ful algal blooms）是指在一定環(huán)境條件下，海洋生物特別是單細(xì)胞藻類迅速增殖或積聚而產(chǎn)生的一種海水變色的自然現(xiàn)象［1］。研究表明，赤潮已經(jīng)對(duì)海洋環(huán)境、天然海洋生物資源、近海養(yǎng)殖業(yè)、近海旅游業(yè)等產(chǎn)生了極大消極作用，其中有毒赤潮藻的影響尤為嚴(yán)重。有毒赤潮藻通過食物鏈不僅影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，而且威脅海洋食品安全。人類食用含有貝類毒素（赤潮藻毒素）的食品時(shí)可能中毒，有些貝類毒素甚至有致死風(fēng)險(xiǎn)。與全球赤潮發(fā)生趨勢一樣，我國近岸海域赤潮發(fā)生頻率一直呈上升態(tài)勢，且近些年東海海域有毒赤潮記錄大幅上升［2－3］。海洋有毒赤潮藻及其產(chǎn)生的貝類毒素已經(jīng)成為當(dāng)今全球赤潮研究的重要內(nèi)容。

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是世界分布最廣、危害最大的一類赤潮藻毒素，它是一類擁有胍基的三環(huán)氨基甲酸酯類化合物及其衍生物，由石房蛤毒素（saxitoxin，STX）及其天然衍生物如膝溝藻毒素（gonyantoxins，GTXs）、新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neoSTX）組成，由海洋有毒甲藻代謝產(chǎn)生。PSP是一類膜神經(jīng)性毒素，可以導(dǎo)致中毒者神經(jīng)麻痹［4］，它有2個(gè)滴定點(diǎn)，pKa分別是8.2和11.5，它們之間很容易相互轉(zhuǎn)化，即毒性低的也可轉(zhuǎn)化為毒性高的?？僧a(chǎn)生麻痹性貝類毒素的有毒赤潮藻包括塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）、巴哈馬麥甲藻扁平變種（Pyrodinium bahamense var．compressum）、鏈狀裸甲藻（Gymnodinium catenatum）等。PSP的基本結(jié)構(gòu)式見圖1［5］。

圖1 PSP的基本結(jié)構(gòu)

目前，常用的PSP檢測方法包括小鼠生物法、高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜?質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、X?射線結(jié)晶分析法、核磁共振檢測法、神經(jīng)受體結(jié)合檢測法、免疫學(xué)檢測技術(shù)、細(xì)胞毒性檢測技術(shù)等，其中免疫學(xué)檢測技術(shù)在實(shí)踐中常用的為酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）［6］。本文比較了小鼠生物法與ELISA法檢測樣品中PSP含量，旨在為一線檢測人員高效、快速、準(zhǔn)確地檢測水產(chǎn)品中PSP含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用縊蟶、釘螺、花蛤、扇貝購自浙江省主要貝類產(chǎn)區(qū)水產(chǎn)市場。試驗(yàn)用小鼠為ICR系雄性小鼠，體重18～20 g；麻痹性貝類毒素檢測試劑盒購自美國ABRAXIS公司；麻痹性貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）購自加拿大國家研究委員會(huì)。其他分析試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

酶標(biāo)儀，精度為0.1 g的電子天平，機(jī)械秒表，均質(zhì)器，冷凍低速離心機(jī)，移液槍，微量多通道加樣器，1 mL注射器，200 m L量筒，電爐，燒杯等。

1.2 樣品處理與制備

用清水徹底洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌或小心敲破釘螺外殼，開殼，用清水淋洗內(nèi)部以去除泥沙及其他外來雜質(zhì)，仔細(xì)取出貝肉，用雙蒸水洗凈取出的貝肉，然后瀝水5 min，撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì)備用。切記不要割破肉體，尤其是腸腺部分要保持完整、不被割破。

縊蟶加標(biāo)樣品按以下步驟處理：分別取往年實(shí)驗(yàn)室檢測任務(wù)中縊蟶PSP陰性樣品3份，每份220 g，分別加入配制好的，含PSP量為132，88和66μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成縊蟶加標(biāo)樣1、縊蟶加標(biāo)樣2和縊蟶加標(biāo)樣3。

1.3 小鼠生物測定法

均質(zhì)樣品中麻痹性貝類毒素提取和小鼠試驗(yàn)參照SC／T 3023—2004［7］的7.2和7.3部分執(zhí)行。

1.4 ELISA法

取10 g均質(zhì)后的貝類樣品或縊蟶加標(biāo)樣品于干凈燒杯中，加0.1mol·L－1 HCl溶液10mL充分?jǐn)嚢?，檢測pH（pH值為2.0～4.0）。需要時(shí)，可逐滴加入5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液調(diào)整pH。將混合物煮沸并攪拌5 min，冷卻后將混合液3 500 r·min－1離心10 min，上清用5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0～4.0。取上清液40μL，用樣品稀釋緩沖液稀釋到1.0 mL，漩渦振蕩1 min；再從上步稀釋的樣品溶液中取50μL用樣品稀釋緩沖液稀釋到2.0 mL，待測。

ELISA檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 定量計(jì)算

縊蟶、釘螺、花蛤、扇貝及縊蟶加標(biāo)樣品小鼠生物法檢測按SC／T 3023—2004計(jì)算PSP含量，檢測結(jié)果單位為鼠單位MU·kg－1；ELISA法定量計(jì)算采用商業(yè)化ELISA分析軟件，檢測結(jié)果單位為μg·kg－1。根據(jù)對(duì)東海區(qū)PSP檢測毒力系數(shù)的經(jīng)驗(yàn)值，按照1 MU＝0.2μg將小鼠生物法檢測結(jié)果進(jìn)行換算。

對(duì)于平行樣，所有計(jì)算取算術(shù)平均值。

2 結(jié)果與分析

檢測結(jié)果見表1。

表1 小鼠生物法與ELISA法檢測結(jié)果比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠生物法和ELISA法均可對(duì)樣品中的PSP進(jìn)行檢測。試驗(yàn)中縊蟶樣品（1～5）、縊蟶樣品加標(biāo)3（PSP加標(biāo)量為300μg·kg－1）小鼠生物法檢測結(jié)果為陰性，即沒有檢出樣品中含有PSP。相同樣品ELISA法檢測結(jié)果分別為13，15，17，16，15和288μg·kg－1，根據(jù)1.4節(jié)中對(duì)樣品前處理的描述，這些樣品上清液的稀釋倍數(shù)為2 000倍，按照ELISA檢測試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品序列可以確定該稀釋倍數(shù)情況下對(duì)樣品中PSP的檢出限為4μg·kg－1，則可以確定縊蟶樣品按照ELISA法進(jìn)行檢測，結(jié)果為陰性，而縊蟶樣品加標(biāo)3的ELISA法檢測結(jié)果為288μg·kg－1，加標(biāo)回收率為96.0%，滿足ELISA法的加標(biāo)回收率范圍（70%～120%）。

從檢測結(jié)果中可以看出，其余樣品按照2種方法檢測，其結(jié)果吻合度較好，其中縊蟶樣品加標(biāo)1（PSP加標(biāo)量為600μg·kg－1）、縊蟶樣品加標(biāo)2（PSP加標(biāo)量為400μg·kg－1）ELISA法的加標(biāo)回收率分別為89.3%和88.0%，滿足ELISA法的加標(biāo)回收率范圍。

根據(jù)SC／T 3023—2004中關(guān)于貝類中麻痹性貝類毒素計(jì)算方式的描述，可以確定使用標(biāo)準(zhǔn)體重為20 g的小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，樣品中PSP檢出限為350μg·kg－1；本試驗(yàn)中ELISA法按照操作步驟進(jìn)行推算，在稀釋倍數(shù)為2 000倍時(shí)，樣品的PSP檢出限為40μg·kg－1，如果將稀釋倍數(shù)降低至1 000倍，則PSP的檢出限則只有20μg·kg－1，大大低于小鼠生物法的檢出限，故在檢測縊蟶樣品加標(biāo)3時(shí)本試驗(yàn)中2種方法的檢測結(jié)果出現(xiàn)差異。

綜上所述，樣品中PSP含量在350μg·kg－1以上時(shí)，2種檢測方法結(jié)果吻合度較好；樣品中PSP含量在350μg·kg－1以下、40μg·kg－1以上時(shí)小鼠生物法無法檢測到樣品中PSP，而應(yīng)用ELISA法可以快速檢測樣品中PSP；本試驗(yàn)中在PSP陰性樣品中二者檢測結(jié)果一致。

3 小結(jié)與討論

通過試驗(yàn)可以看出，在方法檢出限以上范圍內(nèi)，小鼠生物法與ELISA法檢測結(jié)果有較好吻合度，但通常情況下ELISA法檢測結(jié)果略小于小鼠生物法，這主要是因?yàn)樾∈蠓ㄊ菣z測受試樣品中PSP總量，即檢測受試樣品中各種PSP含量的總和，而ELISA法原理是抗原抗體反應(yīng)，目前研究還局限于單抗，即檢測試劑盒中一般只含有比較單一的抗體。本試驗(yàn)中采用的ELISA試劑盒，其所含抗體主要針對(duì)PSP中的STX，對(duì)neo?STX也有一定抗原特異性，故對(duì)STX的反應(yīng)率為100%，對(duì)neo?STX的交叉反應(yīng)率為50%，而對(duì)其他組分的PSP交叉反應(yīng)率較小。

小鼠生物法是檢測PSP的傳統(tǒng)方法，由Sommer的Mayer于1937年創(chuàng)建，目前被美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)確定為PSP標(biāo)準(zhǔn)檢測程序，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、能夠檢測受試樣品中PSP總量，缺點(diǎn)是所需樣品量大、重現(xiàn)性差、受客觀影響（主要是小鼠對(duì)PSP的敏感度）較大、靈敏度低等，且試驗(yàn)中需要用到小鼠，出于對(duì)動(dòng)物福利考慮，該方法在有些國家的應(yīng)用受到限制。

ELISA法屬于新興的PSP檢測方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢出限低、靈敏度高、檢測速度快等，缺點(diǎn)是需要專門儀器設(shè)備、未知受試樣品PSP含量情況下很難準(zhǔn)確確定樣品稀釋濃度、檢測PSP成分較單一等，且目前市售商品化檢測試劑盒價(jià)格相對(duì)較高，這些都影響其普遍應(yīng)用。

將一種檢測方法推向市場，成本會(huì)影響其推廣程度。針對(duì)本文中2種檢測PSP的方法，小鼠生物法檢測單一樣品費(fèi)用大約為100元，ELISA法檢測單一樣品費(fèi)用超過1 000元，主要是因?yàn)樾∈笊锓軌蚋鶕?jù)小鼠死亡時(shí)間及體重按照檢測標(biāo)準(zhǔn)提供的換算關(guān)系直接計(jì)算樣品中PSP含量，而ELISA法每次檢測必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)受檢樣品在試劑盒微孔上產(chǎn)生的吸光度間接計(jì)算樣品中PSP含量。一般商品化試劑盒含有96個(gè)微孔及其檢測過程必需標(biāo)準(zhǔn)品、試劑，批量檢測時(shí)按照本文操作步驟至少可以檢測超過30個(gè)樣品，而如果每次僅檢測一個(gè)樣品，則每個(gè)檢測試劑盒可檢測樣品量不會(huì)超過5個(gè)，因此用ELISA法更適合批量檢測，從而降低檢測費(fèi)用。

日常檢測中，將2種方法適當(dāng)結(jié)合能夠起到互補(bǔ)作用，能夠保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

［1］ 陸斗定.全球赤潮生態(tài)學(xué)與海洋學(xué)（GEOHAB）國際合作計(jì)劃［J］.海洋學(xué)研究，2002，20（1）：60－64.

［2］ 陸斗定，Gobel J，王春生，等.浙江海區(qū)赤潮生物監(jiān)測與赤潮實(shí)時(shí)預(yù)測［J］.海洋學(xué)研究，2000，18（2）：33－42.

［3］ 舟山市海洋與漁業(yè)局.2004年舟山海洋環(huán)境公報(bào)［EB／OL］.舟山：舟山市海洋與漁業(yè)局，2005.http：／／www. zsoaf.gov.cn／files／news05032101.doc.

［4］ Baden D G，F(xiàn)leming L E，Bean J A.Marine toxins［J］. Handbook of Clinical Neurology，1995，21（65）：75－141.

［5］ Viviani R.Eutrophication，marine biotoxins，human health［J］.Science of the Total Environment，1992（S）：631－662.

［6］ 杜偉，陸斗定.有毒赤潮藻及其毒素的危害與檢測［J］.海洋學(xué)研究，2008，26（2）：89－97.

［7］ ST／C 3023—2004麻痹性貝類毒素的測定生物法［S］.

（責(zé)任編輯：萬 晶）

S 917.4

A

0528?9017（2015）11?1726?03

文獻(xiàn)著錄格式：杜偉，王揚(yáng)，張曉輝，等.小鼠生物法與ELISA法檢測麻痹性貝類毒素的比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）：1726－1728.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151109

2015?09?15

杜 偉（1981－），男，山東聊城人，工程師，碩士，主要從事赤潮生物、海洋環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量安全等研究工作。E?mail：david?8?0＠163.com。

王 揚(yáng)（1973－），女，浙江舟山人，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全等研究工作。E?mail：1752315020＠qq.com。