高鳳娟 孫興懷 陳君毅 張圣海 張懿 高鳳 吳強 吳繼紅

·基礎(chǔ)研究·

慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜線粒體復合物活性與氧化應(yīng)激的動態(tài)變化研究△

高鳳娟＊孫興懷 陳君毅 張圣海 張懿 高鳳 吳強＊吳繼紅

目的研究慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜5個線粒體呼吸鏈復合物(MRCCs)活性及氧化應(yīng)激的動態(tài)變化，探索高眼壓視網(wǎng)膜氧化損傷機制，為進一步闡明青光眼視神經(jīng)損害的復雜分子機制提供實驗數(shù)據(jù)。方法挪威鼠前房注射磁珠建立慢性高眼壓模型。分別在術(shù)后0、1、2、4周，視網(wǎng)膜冷凍切片檢測活性氧(ROS)含量；制備視網(wǎng)膜組織勻漿，檢測5個MRCCs、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、銅/鋅-超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD) 活性及丙二醛(MDA)含量變化。使用 SPSS16.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。結(jié)果挪威鼠前房磁珠注射后眼壓較注射前及對照組均顯著升高；慢性高眼壓后，MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ活性迅速顯著降低，以MRCC Ⅲ 下降幅度最大(P<0.01)；MRCCⅣ、Ⅴ的活性在第1周短暫升高后也顯著降低(P<0.01)；T-SOD、Cu/Zn-SOD 活性在前2周升高，到4周時顯著降低(P<0.05)，Mn-SOD 活性在眼壓升高后即迅速大幅度降低(P<0.05)；高眼壓組視網(wǎng)膜MDA及ROS含量顯著增加(P<0.001)。結(jié)論慢性高眼壓引起視網(wǎng)膜MRCCs活性及抗氧化能力下降，導致線粒體功能障礙、視網(wǎng)膜ROS及氧化產(chǎn)物增加等損傷性變化。(中國眼耳鼻喉科雜志，2015，15：379-383)

慢性高眼壓模型；線粒體復合物活性；氧化應(yīng)激；超氧化物歧化酶；丙二醛；活性氧；大鼠

青光眼視神經(jīng)病變是全球第1位不可逆性致盲眼病[1-2]。到目前為止，引起青光眼視神經(jīng)損害的機制尚不十分清楚，但是大量研究[3-4]已經(jīng)證實，氧化應(yīng)激在青光眼視神經(jīng)病變中起著至關(guān)重要的作用。然而青光眼視神經(jīng)病變中，有關(guān)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因及具體機制鮮有深入研究。線粒體呼吸鏈是細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的主要位點，是氧化應(yīng)激的根源[5]，提示線粒體在青光眼視神經(jīng)病變氧化損傷中起關(guān)鍵作用[6]。我們的前期體外研究證實：壓力可以引起體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞(retina astrocytes, RA)線粒體形態(tài)和功能異常，導致RA內(nèi)ROS增加以及抗氧化能力下降等損傷性變化；體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)：慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中線粒體DNA損傷及突變增加[7]，但是在慢性青光眼動物模型中，線粒體呼吸鏈復合物(mitochondrial respiratory chain complexes，MRCCs)的功能及氧化應(yīng)激的動態(tài)改變?nèi)绾文?？為此本研究系統(tǒng)探討慢性高眼壓動物模型視網(wǎng)膜5個MRCCs活性及氧化應(yīng)激的動態(tài)變化，進一步探索慢性高眼壓視網(wǎng)膜氧化損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 挪威大鼠慢性高眼壓模型建立及分組 22周齡健康雄性挪威大鼠，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。符合國家醫(yī)用動物使用標準，標準號為清潔級，檢證字:SCXK 滬 2008-0016 (上海市實驗動物質(zhì)量合格證號)。室溫下10%水合氯醛注射挪威大鼠腹腔致全身麻醉(0.3 mL/100 g)，用33-G微量注射器抽取6～8 μL 50 mg/mL的超順磁性氧化鐵，緩慢推入前房。用小磁鐵吸附注入前房的磁珠，在眼周圍輕輕移動小磁鐵，使磁珠在眼前房均勻分散開，阻塞小梁網(wǎng)。右眼不作處理。將2組挪威大鼠分別于術(shù)前1 d及術(shù)后1、3、5、7、14、21、28 d給予測眼壓，每日上午8:30～10:00用Tono-Pen XL測量眼壓，取3次可信測量值(變異概率≤5%)的平均眼壓。每日術(shù)眼滴左氧氟沙星滴眼液1次，連續(xù)滴1周；每日顯微鏡下觀察結(jié)膜、角膜、前房的炎癥情況。模型成功的判斷標準：眼壓>21 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或眼壓高于非手術(shù)眼5 mm Hg，且高眼壓連續(xù)持續(xù)7 d以上為造模成功[8]。選取18只造模成功鼠(左眼)納為實驗組，18只正常挪威大鼠(左眼)為對照組。

1.2 ROS含量測定 高眼壓2周及同齡挪威大鼠麻醉處死后，快速取出眼球，立即放入預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline ,PBS)中漂洗，剪除角膜，剜除晶狀體，包埋劑混合物(opti-mum cutting temperature compound， OCT)進行組織包埋；-80 ℃冰箱冷凍包埋1 h后，用冷凍切片機制備厚約10 μm的視網(wǎng)膜冷凍切片，將切片置于載玻片上。按照冷凍切片氧化應(yīng)激ROS高質(zhì)熒光測定試劑盒說明書加入ROS染色液。熒光顯微鏡下觀察ROS水平并拍照。

1.3 視網(wǎng)膜組織勻漿的制備 高眼壓0、1、2、4周及同齡對照組挪威大鼠處死，立即摘取眼球，分離視網(wǎng)膜，加入勻漿介質(zhì)(0.9%生理鹽水+1%苯甲基磺酰氟)超聲破碎,制備成10%的組織勻漿。根據(jù)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白測定試劑盒(碧云天)說明書測定蛋白濃度。

1.4 MRCCs活性測定 利用MRCCs活性定量檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)檢測MRCCs活性。檢測步驟按試劑盒說明，啟動反應(yīng)后，應(yīng)用多功能酶標儀(美國Bio-tak)在相應(yīng)波長下掃描，通過計算求出各樣品的MRCCs活性(μmol·min-1·mg-1)。1.5 SOD活性及MDA含量測定 應(yīng)用SOD分型試劑盒及MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，嚴格按照試劑盒說明書，采用黃嘌呤氧化酶法測定550 nm處吸光度值，通過計算可求出被測樣品中SOD活力 (U/mgpro)。MDA含量測定在532 nm處有最大吸收峰，單位為nmol/mgprot。

2 結(jié)果

2.1 眼壓 25只挪威大鼠術(shù)前平均眼壓為(10.60±0.42)mm Hg，前房磁珠注射1周后有23只鼠眼壓較對照組顯著升高(P<0.001)，平均眼壓為(37.00±5.46)mm Hg，造模成功率為92%；術(shù)后2、3、4周后平均眼壓為(33.50±3.58)、(30.60±3.95)、(25.00±4.20)mm Hg，均較對照組顯著升高(P<0.01)(表1、圖1)。

表1 2組挪威大鼠的術(shù)前及術(shù)后眼壓(mm Hg)

注：與正常對照組相比，a示P<0.01，b示P<0.001

2.2 慢性高眼壓挪威大鼠視網(wǎng)膜5個MRCCs的活性動態(tài)變化 2組挪威大鼠各時間點5個MRCCs的活性見表2。與正常對照組相比，MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ的活性在眼壓升高第1周即顯著降低，分別下降了32.61%(P<0.01)、69.61%(P<0.01)、80.33%(P<0.01)，隨后MRCCⅠ的活性繼續(xù)降低，到第4周時已降低了65.63%，而MRCCⅡ、Ⅲ到第4周時有輕度回升，但仍顯著低于正常對照組(P<0.01)；MRCCⅣ、Ⅴ的活性在眼壓升高第1周時分別增加了38.19%、7.11%(P<0.05)，但隨后迅速降低，到第4周時分別降低了37.19%(P<0.01)、65.63%(P<0.001)(圖2)。

圖1. 挪威大鼠前房磁珠注射后眼壓變化 NC為正常對照組，COH為慢性高眼壓組；與正常對照組相比，**示P<0.01，***示P<0.001

表2 2組挪威大鼠各時間點5個MRCCs的活性(μmol·min-1·mg-1)

注：與正常對照組相比，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

圖2. 各組挪威大鼠不同時間點5個MRCCs的活性變化 NC為正常對照組，COH為慢性高眼壓組； 與正常對照組相比，*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001

2.3 各組視網(wǎng)膜組織SOD活性及MDA含量動態(tài)變化 各組挪威大鼠不同時間點視網(wǎng)膜組織SOD活性及MDA含量見表3。由圖3可以看出，慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜T-SOD、Cu/Zn-SOD活性在術(shù)后前2周是升高的，到第2周時分別升高了24.14%、56.28%(P<0.01)，到眼壓升高第4周時才顯著低于對照組，其中T-SOD降低了38.85%(P<0.001),而Cu/Zn-SOD僅降低了19.58%(P<0.05)；然而位于線粒體內(nèi)的Mn-SOD在眼壓升高第1周即迅速降低，到第4周時已經(jīng)降低了75.68%(P<0.05)。視網(wǎng)膜組織內(nèi)的MDA含量在慢性高眼壓后即逐漸升高，到第2周時已顯著增加了2.03倍(P<0.001)。

2.4 慢性高眼壓視網(wǎng)膜組織ROS含量變化 為了進一步驗證慢性高眼壓挪威大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)氧化應(yīng)激的存在，我們又在視網(wǎng)膜冷凍切片上原位檢測了ROS的含量變化。正置熒光顯微鏡觀察(圖4)，ROS呈綠色熒光。慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜各層內(nèi)均可見綠色熒光，且熒光強度顯著高于對照組。

表3 SOD活性(U/mgpro)及MDA含量(nmol/mgprot)

注：與正常對照組相比，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

圖3. 各組挪威大鼠不同時間點視網(wǎng)膜T-SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD活性及MDA含量變化 NC為正常對照組，COH為慢性高眼壓組；與正常對照組相比，*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001

圖4. 挪威大鼠慢性高眼壓(COH)2周及同齡對照組(NC)視網(wǎng)膜冷凍切片原位ROS檢測的熒光照片 綠色熒光標記為ROS，藍色熒光為細胞核(×10)

3 討論

科學有效地構(gòu)建動物模型是進行實驗研究首要的必需條件，我們將磁珠注射至挪威鼠前房以阻塞小梁網(wǎng)達到眼壓升高的目的，成模率高，操作相對簡單，對眼部損傷較小，并發(fā)癥少，單次注射眼壓升高可持續(xù)2周；且通過2次磁珠注射可以使眼壓升高持續(xù)8周甚至更長[9]，可以排除眼壓波動對實驗結(jié)果的干擾，使得結(jié)果更加科學、可信。

MRCCs主要由5個酶復合物(復合物Ⅰ～Ⅴ)構(gòu)成，是合成ATP和產(chǎn)生ROS的重要場所[10]。本研究動態(tài)監(jiān)測了慢性高眼壓1、2、4周后大鼠視網(wǎng)膜5個MRCCs的活性變化，結(jié)果顯示5個MRCCs的活性均顯著降低，提示慢性高眼壓作用下視網(wǎng)膜MRCCs功能出現(xiàn)異常。其中MRCC Ⅰ～Ⅲ的活性在眼壓升高后立即下降，且以MRCC Ⅲ下降幅度最大，提示MRCCⅢ可能對壓力損傷最敏感，很可能是壓力作用于線粒體損傷的始動部位。MRCCs活性下降進一步導致ROS產(chǎn)生增加，氧化損傷加重，如此形成惡性循環(huán)，啟動視網(wǎng)膜內(nèi)引起細胞死亡的級聯(lián)反應(yīng)。但是MRCC Ⅳ和Ⅴ的活性在眼壓升高第1周時有短暫升高，這可能與它們的代償能力較強、對壓力損傷的敏感度較低有關(guān)，且它們并不是產(chǎn)生ROS的原發(fā)部位，只有當ROS累積到一定水平并超出其代償能力后，才產(chǎn)生明顯的損傷作用，表現(xiàn)為活性下降。

SOD是視網(wǎng)膜抗氧化系統(tǒng)的主要成分之一，細胞內(nèi)的SOD分為2型：Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。前者主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，而后者主要位于線粒體基質(zhì)內(nèi)，是線粒體內(nèi)清除自由基最重要的抗氧化酶[11-12]。因此，檢測SOD的活性可以很好地反映機體抗氧化系統(tǒng)的損傷情況。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要終產(chǎn)物，其含量的測定間接反映了細胞受自由基攻擊的脂質(zhì)過氧化程度[13]。我們的研究顯示，T-SOD、Cu/Zn-SOD活性在眼壓升高前2周代償性升高，然而MDA和ROS含量在眼壓升高后即顯著升高，提示SOD活性的升高并沒有完全代償以清除壓力損傷產(chǎn)生的過多ROS。于是我們檢測線粒體內(nèi)的主要抗氧化酶Mn-SOD，結(jié)果顯示，其活性在眼壓升高后迅速大幅度降低。根據(jù)文獻報道，Mn-SOD在線粒體的抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮非常基礎(chǔ)但重要的作用，且其在線粒體內(nèi)的含量非常低。當其活性下降后，將對線粒體的抗氧化能力產(chǎn)生嚴重影響，致其功能障礙甚至崩解[14]。因此我們考慮慢性高眼壓時，視網(wǎng)膜線粒體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的損傷均較早、較嚴重，且由于MRCCⅢ活性降低產(chǎn)生大量ROS，導致線粒體內(nèi)很早即出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，并形成惡性循環(huán)，進而導致細胞損傷、功能障礙。

本研究提示，慢性高眼壓時線粒體功能障礙、MRCCⅢ活性下降及線粒體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)損傷與視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，因此專門用于提升線粒體MRCCⅢ及抗氧化活力的、有特定作用靶點的作用劑研究，很可能會對青光眼這類疾病有一定的幫助。這也將是今后青光眼領(lǐng)域工作者研究的一個方向，將對青光眼的早期診斷及干預帶來新思路。 此外，本研究也為青光眼視神經(jīng)病變機制的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，為進一步的研究提供了新的方向。

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(本文編輯 諸靜英)

Dynamic changes of the mitochondrial complexes activities and oxidative stress in the retinas of chronic ocular hypertension rat models

GAOFeng-juan＊,SUNXing-huai,CHENJun-yi,ZHANGSheng-hai,ZHANGYi,GAOFeng,WUQiang＊,WUJi-hong.

DepartmentofOpthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong, Email: jihongwu@fudan.edu.cn

Objective To investigate the dynamic changes of the all mitochondrial respiratory chain complexes (MRCCs) activities and levels of oxidative stress of the retina, and to reveal the mechanism of oxidative stress injury in retina of high intraocular pressure (IOP) which would provide experimental data for further clarification of the complex molecular mechanisms of glaucoma optic nerve damage. Methods Chronic ocular hypertension was induced by injecting magnetic beads in the anterior chamber of Brown Norway rats. Tissue homogenate of retinas were obtained at different time point of high IOP. Biochemical methods were used to test the activities of all MRCCs, total superoxide dismutase(T-SOD), Cu/Zn-SOD, Mn-SOD and the content of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS). Statistical analysis was performed by using SPSS16.0. Results A sustained IOP increase was achieved in 92% of Brown Norway rats. MRCC Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ activities decreased when IOP was elevated(P<0.01) and MRCC Ⅲ declined with the greatest fall range; MRCC Ⅳand Ⅴ increased in the first week but declined rapidly then(P<0.01). Activities of T-SOD and Cu/Zn-SOD increased in the first two weeks before they declined(P<0.05), while Mn-SOD activities showed a sharply downward trend(P<0.05); Mount of MDA and ROS was significantly increased in the chronic ocular hypertension group. Conclusions Chronic ocular hypertension leads to reduction of MRCCs activities and antioxidation ability in the retina which directly results in mitochondrial dysfunction and overproduction of ROS and MDA. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:379-383)

Chronic high intraocular pressure model; Mitochondrial complex activity; Oxidative stress; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Reactive oxygen species; Rat

國家自然科學基金(81470624, 81470625, 81470623)；上海市衛(wèi)生局局級科研項目(20124073)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031；＊上海市第六人民醫(yī)院眼科 上海 200030

吳繼紅(Email：jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.001

2015-04-27)