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SPR技術(shù)檢測(cè)血小板抗體及其臨床應(yīng)用的研究*

2015-03-05 05:08:34伍昌林周雪敏何建安顧大勇邵超鵬
重慶醫(yī)學(xué) 2015年9期
關(guān)鍵詞:點(diǎn)樣抗原血小板

伍昌林,周雪敏,何建安,顧大勇,朱 奕,邵超鵬

(1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院輸血科 518035;2.廣東省深圳市福田區(qū)慢病防治院 518048;3.廣東省深圳市檢驗(yàn)檢疫局保健中心 518045)

輸注血小板可預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能缺陷引起的出血,但患者多次輸血后,易產(chǎn)生血小板相關(guān)抗體,導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效(PTR)[1]。目前,檢測(cè)血小板抗體與交叉配合試驗(yàn)主要是固相法、MAIPA 法和FCM 法等,這些方法或者試劑昂貴,成本較高,增加了患者的負(fù)擔(dān);或者檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),步驟較多,對(duì)結(jié)果可靠性產(chǎn)生一定影響[2],同時(shí)該方法指示紅細(xì)胞的保存期短,易造成試劑浪費(fèi)等。表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)是應(yīng)用非標(biāo)記光學(xué)生物傳感器技術(shù),不需要對(duì)被測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記使其可以測(cè)量生物活性分子的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),適用于高通量生物活性分子特別是小分子的篩選,微量未知物的分析,以及在線樣品檢測(cè),具有高靈敏度、高通量、非標(biāo)記、樣品和試劑耗量小等優(yōu)點(diǎn)[3-6]。因此,作者研究基于SPR 的非標(biāo)記技術(shù)在血小板抗體篩選與配型中的初步應(yīng)用,并以經(jīng)典的參考法單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)(MAIPA)進(jìn)行對(duì)比分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年5月至2013年4月在深圳市第二人民醫(yī)院多次輸注血小板的患者106例[至少2次輸注血小板,其中,特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者34例,白血病患者46例,骨髓增生異常綜合征(MDS)8例,其他病例18例],其中,男55例,女51例,年齡8~63歲,中位年齡34.5歲?;颊哐“逵?jì)數(shù)均小于20×109/L或大于20×109/L 且小于100×109/L,但有明顯出血傾向。

1.2 標(biāo)本采集處理與血小板計(jì)數(shù) 分別在血小板輸注前和輸注后1、24h采集患者外周靜脈血2 mL,進(jìn)行血小板計(jì)數(shù),并計(jì)算血小板增加值(corrected count index,CCI)。CCI=輸注后血小板增加值×體表面積(m2)/輸入血小板總數(shù),體表面積=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×體質(zhì)量(kg)-0.015 29。以1hCCI>7.5或24hCCI>4.5為有效,否則為輸注無(wú)效。供者的單采血小板由血液中心提供,每袋容量約200 mL 左右,含血小板大于或等于2.5×1011/袋。

1.3 主要儀器與試劑 SPR 分析儀(美國(guó)GWC 公司,SPRimager?Ⅱ型),MAIPA 試劑盒(美國(guó),Immucor公司),BYL 型離心機(jī)(長(zhǎng)春博研公司),SPR 檢測(cè)芯片(批號(hào)20130124,廣州高通生物技術(shù)有限公司)。通用型O 型血小板凍干粉(批號(hào)20120923)、血小板抗體陽(yáng)性血清(批號(hào)20120916,陽(yáng)性對(duì)照)購(gòu)自長(zhǎng)春博德公司。芯片活化液EDC/NHS:1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC,0.4mol/L)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,0.1mol/L)、pH=7.4的緩沖液PBS(流動(dòng)相)及再生液甘氨酸(10 mmol/L,pH =2.0),封閉液乙醇胺(1mmol/L,pH=8.5),健康人AB型血清(陰性對(duì)照)、非特異性蛋白NS1對(duì)照血清由本室提供。

1.4 SPR 技術(shù)檢測(cè)血小板抗體條件摸索與方法建立

1.4.1 血小板在SPR 芯片表面固定的影響因素 影響SPR芯片表面血小板固定的因素:主要是離子強(qiáng)度,溶液的pH 值及蛋白抗原的濃度等。本研究是在一定的離子強(qiáng)度下,將血小板抗原進(jìn)行倍比稀釋后,分別點(diǎn)樣芯片,根據(jù)不浪費(fèi)樣品,又能保證達(dá)到一定的固定量的原則,確定血小板抗原的稀釋度。本研究選用不同pH 值(分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)的10 mmol/L醋酸鹽緩沖溶液作為血小板的固定液,探索pH 值對(duì)血小板抗原固定的影響,確定最佳pH 值。

1.4.2 血小板在SPR 芯片表面固定的方法 血小板抗原的固定:根據(jù)前期條件探索,采用氨基耦聯(lián)法在SPR 傳感芯片表面固定相應(yīng)的通用型血小板抗原,檢測(cè)相應(yīng)的血小板抗體。具體的方法:(1)SPR 芯片活化:先室溫下分別溶解0.393 9g EDC(0.4mmol/L)和0.430g NHS(0.1mmol/L),配制成10 mL EDC/NHS 活化液,將SPR 芯片置于活化液中活化30 min,流水沖洗;(2)血小板抗原點(diǎn)樣:用pH 值為6.0 的10 mmol/L乙酸鹽與甘油配制10%的甘油點(diǎn)樣液,將通用型血小板抗原用點(diǎn)樣液作5倍稀釋處理后,取0.5μL 混合液點(diǎn)樣于芯片表面相應(yīng)的位置,室溫下固定1h;(3)芯片表面封閉:將點(diǎn)樣好的SPR 芯片,固定后,安裝在SPR 分析儀上,用PBS液調(diào)選最佳共振角(由最小角至最大角調(diào)試,再確定最佳的共振角約為70~100 之間),基線平穩(wěn)后,用封閉液乙醇胺處理10 min,封閉芯片未反應(yīng)的活化表面。完成后用再生液處理,去除物理吸附的物質(zhì)和封閉液,然后可上樣檢測(cè)。

1.4.3 芯片表面的再生試劑與再生效果 進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)時(shí),先將待檢血清用PBS溶液稀釋后,注入芯片上,每測(cè)一個(gè)樣本后,用再生液再生芯片,然后進(jìn)行下一次測(cè)定,結(jié)果用BIAevaluation軟件分析。芯片的表面再生原理是利用一定濃度的酸、堿或者是高離子強(qiáng)度的溶液脈沖來(lái)洗脫抗原與抗體間的結(jié)合,從而達(dá)到傳感芯片的再生。關(guān)于采用再生試劑中本研究嘗試采用了10 mmol/L NaOH,1∶300稀釋的磷酸、pH=2.0的甘氨酸作為再生試劑,確定最佳的再生試劑類(lèi)型。

1.4.4 血小板抗原與抗體之間的結(jié)合及性能分析 (1)SPR技術(shù)性能分析:運(yùn)用上述探索的條件及固定的SPR 芯片,將陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、患者樣本等作相應(yīng)的檢測(cè),分析SPR 技術(shù)的穩(wěn)定性、敏感度、特異性,SPR 分析儀檢測(cè)的數(shù)據(jù)運(yùn)用BIAevaluation軟件分析;(2)對(duì)比研究:運(yùn)用SPR 技術(shù)與MAIPA 法(具體操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)同時(shí)對(duì)106 例多次輸注血小板的患者進(jìn)行血小板抗體篩選,比較2種方法的差異性,并分析它們的性能。

1.5 SPR 芯片技術(shù)在抗體篩選與配型中的初步應(yīng)用 對(duì)患者采用SPR 技術(shù)作配合性試驗(yàn),選擇配合型血小板輸注,并跟蹤分析臨床療效。具體檢測(cè)方法:將已知的O 型通用血小板(抗原)固定在芯片上,檢測(cè)患者血清中是否有相關(guān)抗體;同樣將血液中心供應(yīng)的機(jī)采血小板洗滌后稀釋?zhuān)∥⒘浚?.5μL)點(diǎn)樣于芯片上,檢測(cè)血小板抗體陽(yáng)性患者的血清是否存在SPR信號(hào)的改變,若無(wú)信號(hào)改變,說(shuō)明它們是配型相合,否則為配型不相合。運(yùn)用該技術(shù)對(duì)10例血小板抗體陽(yáng)性患者選擇配合的血小板進(jìn)行輸注,并進(jìn)行臨床跟蹤分析,研究患者臨床血小板輸注的有效性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血小板固定濃度的條件摸索結(jié)果 采用乙酸緩沖溶液稀釋血小板,分別稀釋5、10、20、50、100倍。結(jié)果表明隨著點(diǎn)樣的濃度增加檢測(cè)分析物(含血小板抗體血清)信號(hào)值增加,稀釋到10 倍后,點(diǎn)樣物的濃度對(duì)檢測(cè)信號(hào)影響不明顯(圖1),因此,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,確定點(diǎn)樣的血小板濃度均采用10 倍稀釋度。

圖1 血小板固定濃度的條件優(yōu)化結(jié)果

圖2 點(diǎn)樣液pH 值的條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 點(diǎn)樣液pH 值的條件摸索結(jié)果 分別采用系列pH 值(分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)的乙酸緩沖溶液作為點(diǎn)樣液稀釋血小板。通入分析物(含血小板抗體血清)結(jié)果表明在pH=4.5的乙酸緩沖溶液時(shí)具有較強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)(圖2)。因此,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均采用pH=4.5的乙酸緩沖溶液作為點(diǎn)樣液固定血小板。

2.3 SPR 芯片檢測(cè)血小板抗體的再生試劑與再生效果 在NaOH 的緩沖溶液中,高分子鏈部分水解,導(dǎo)致基線往下漂移,而采用1∶300稀釋的磷酸基線沒(méi)有回到原始基線水平即再生徹底。在采用pH=2.0的甘氨酸再生后基線基本回到初始值水平,而且再生后探針仍然保持較高的生物活性。故本文采用了pH=2.0的甘氨酸作為再生試劑。在SPR 芯片上將試劑血小板抗原(包括較多的血小板抗原位點(diǎn))點(diǎn)樣于不同的位置,進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照血清的檢測(cè)分析后,再用pH=2.0的甘氨酸作為再生試劑,重復(fù)3次檢測(cè),每次檢測(cè)信號(hào)均可回到基線,結(jié)果良好(圖3)。

圖3 SPR 芯片檢測(cè)陽(yáng)性血清后的再生效果(n=3)

2.4 SPR 芯片分析血小板抗體陽(yáng)性血清的檢測(cè)限 在同一張芯片上點(diǎn)樣試劑血小板抗原,并選擇相應(yīng)的7個(gè)區(qū)域,其中,1個(gè)為空白對(duì)照點(diǎn),另外6個(gè)為樣本檢測(cè)點(diǎn),分別取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照陽(yáng)性血清5、10、20、30、40、60μL,對(duì)應(yīng)的濃度分別為50、100、200、300、400、600ng/mL;以2μL/s的流速進(jìn)樣檢測(cè),由BIAevaluation分析軟件處理,去除空白對(duì)照值后作圖如下,對(duì)應(yīng)的RU 值如a、b、c、d、e、f曲線所示,具有較好的靈敏度,最低檢測(cè)限為50ng/mL左右(圖4)。

圖4 SPR 芯片檢測(cè)不同濃度的血小板抗體陽(yáng)性血清的結(jié)果

2.5 SPR 芯片的特異性響應(yīng)結(jié)果 在同一張芯片上點(diǎn)樣試劑血小板抗原與非特異性NS1抗原,其中,1個(gè)點(diǎn)樣為空白對(duì)照點(diǎn),其余各點(diǎn)為樣本檢測(cè)點(diǎn),將此點(diǎn)樣好的芯片在SPR 儀上分別檢測(cè)血小板抗體陽(yáng)性對(duì)照血清與NS1 抗體陽(yáng)性對(duì)照血清,檢測(cè)血小板抗體陽(yáng)性對(duì)照血清與NS1抗體陽(yáng)性對(duì)照血清時(shí),該芯片特異性較好(圖5)。本研究表明SPR 芯片能特異檢測(cè)血小板抗體(圖5)。

2.6 SPR 芯片技術(shù)與MAIPA 法篩選血小板抗體對(duì)比分析 對(duì)106例臨床多次輸注血小板的患者血清,分別用SPR 芯片技術(shù)和MAIPA 法檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表1;經(jīng)χ2檢驗(yàn),χ2=0.333,P=0.564,2種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPR 法的靈敏度為91%,特異性為97.9%,總一致性為97.2%(表1)。

圖5 SPR 芯片檢測(cè)2種不同陽(yáng)性對(duì)照血清的信號(hào)結(jié)果

表1 2種血小板抗體檢測(cè)方法的結(jié)果比較(n=106,n)

2.7 SPR 芯片技術(shù)檢測(cè)血小板抗體的初步應(yīng)用 將A、B、O同型的供者血小板樣本,經(jīng)洗滌后稀釋?zhuān)凑丈鲜鲅“妩c(diǎn)樣的條件與方法,點(diǎn)樣于SPR 芯片上,然后根據(jù)前面的檢測(cè)方法,分析患者的血清樣本與供者機(jī)采血小板的相容性。本研究對(duì)SPR 技術(shù)檢測(cè)的其中10例血小板抗體陽(yáng)性患者,進(jìn)行交叉配合試驗(yàn),從多位血小板供者中選擇配合型血小板輸注,經(jīng)過(guò)臨床隨訪分析,其中,8例患者1h血小板增加值CCI>7.5,24hCCI>4.5,為輸注有效,并且患者狀態(tài)良好,另外2例因有其他基礎(chǔ)疾病。說(shuō)明SPR 技術(shù)可初步應(yīng)用于臨床血小板的抗體篩選與配型(圖6)。

圖6 供者血小板與患者血清交叉配合試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

如何有效輸注血小板,提高臨床療效是研究的熱點(diǎn)課題。由于建立已知HLA 和HPA 基因位點(diǎn)的供者庫(kù),規(guī)模大,費(fèi)用昂貴,耗時(shí)長(zhǎng),暫時(shí)無(wú)法全面實(shí)施,因此,選擇供受者相同的HLA、HPA 的血小板進(jìn)行輸注目前難以實(shí)施。如果直接通過(guò)配合試驗(yàn)選擇與受者相合的血小板,需要一種簡(jiǎn)便適用的檢測(cè)方法[7-8]。目前,國(guó)內(nèi)外臨床上檢測(cè)血小板抗體與配型的方法主要是固相凝集法、酶標(biāo)法、熒光法等,雖然這些方法可檢測(cè)血小板抗體,并可進(jìn)行血小板配型。但是,該方法也存在較多的問(wèn)題,需要改進(jìn)或開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法[9-11]。目前,臨床上常用MAIPA 法、固相凝集法等,但有一定的缺陷,該方法指示紅細(xì)胞的保存期短,易造成試劑浪費(fèi);檢測(cè)的步驟多,影響因素較多,如ELISA 法,易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性;該方法進(jìn)行臨床檢測(cè)時(shí)需要較多混合的O 型血小板,但血小板表面抗原的復(fù)雜性,抗原譜不明確,易造成抗體的漏檢。因此,需要進(jìn)一步改進(jìn)研究或采用新的檢測(cè)方法。

SPR 技術(shù)不需要對(duì)被測(cè)物進(jìn)行標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)使其可以測(cè)量生物分子在無(wú)修飾條件下的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[12]。因此,SPR 技術(shù)適用于高通量生物分子的直接篩選與在線樣品檢測(cè)。作者將SPR 技術(shù)引入血小板抗體的檢測(cè)與配型的研究上,取得了較好的預(yù)期成果,充分體現(xiàn)了SPR 技術(shù)快速、非標(biāo)記、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)[9]。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn),SPR 技術(shù)檢測(cè)血小板抗體的穩(wěn)定性、靈敏度與特異性均較好,同時(shí)與MAIPA 法檢測(cè)血小板抗體的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比研究,它們陽(yáng)性與陰性結(jié)果的一致性均在95%以上,總有效率也是95%以上。本研究運(yùn)用SPR技術(shù)配型的血小板輸注給10例抗體陽(yáng)性的患者,經(jīng)臨床隨訪分析效果良好,其中,8例患者1h血小板增加值CCI>7.5,24hCCI>4.5,另外2例患者因有其他疾病,影響了血小板輸注的有效率。

SPR技術(shù)不需指示細(xì)胞,克服了MAIPA 法等指示細(xì)胞保存期短的問(wèn)題,另外MAIPA 法操作步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、易出現(xiàn)假陽(yáng)性等;SPR 技術(shù)可批量點(diǎn)樣,大量檢測(cè),速度更快;直接檢測(cè)時(shí),無(wú)需標(biāo)記與指示,影響因素少,結(jié)果更穩(wěn)定。此外,SPR 技術(shù)成熟后,運(yùn)用機(jī)器點(diǎn)樣,一張芯片將檢測(cè)更多樣本,同時(shí)能再生處理,多次重復(fù)使用,檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)成本將更低。

但是,SPR 技術(shù)使用的血小板譜抗原作為點(diǎn)樣抗原,抗原譜的復(fù)雜性,可能存在抗原譜不全面,可能會(huì)出現(xiàn)血小板稀有抗體漏檢的問(wèn)題。隨著基因組學(xué)與蛋白組學(xué)的發(fā)展,血小板抗原的全面檢測(cè),該問(wèn)題將會(huì)解決;此外SPR 技術(shù)的自動(dòng)化點(diǎn)樣、檢測(cè)與分析的研發(fā)也有待加強(qiáng)。作者相信SPR 技術(shù)成熟后,臨床應(yīng)用將更加簡(jiǎn)便,直接篩查血小板抗體、通過(guò)配合試驗(yàn)選擇與受血者相合的血小板顯得更加容易[13-15],該技術(shù)將應(yīng)用于臨床日常檢測(cè)工作中。

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