崔海忠，肖 娜，張永平，陳大貴，唐一通△，趙雪紅，邵金輝

（湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院：1.棗陽臨床學(xué)院腫瘤科，湖北棗陽441200；2.分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽441053）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA 序列上發(fā)生的單個(gè)核苷酸堿基的變異，在人群中的分布率占1%以上。SNP是人類基因組中最常見的變異形式，現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報(bào)道了超過900萬個(gè)SNP位點(diǎn)。SNP被認(rèn)為是疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素，開展SNP 研究對(duì)醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、臨床診斷、藥物開發(fā)與合理用藥等的發(fā)展都具有非常重要的意義［1］。SNP 的基因分型檢測(cè)工作，已成為當(dāng)前國際上研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的快速發(fā)展，SNP檢測(cè)方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快。目前，有20余種SNP突變檢測(cè)方法，如限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）［2］，PCR-SSCP［3］，DNA 測(cè)序，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）［4］，TaqMan PCR［5］，焦 磷 酸 測(cè) 序（Pyrosequencing）［6］，質(zhì)譜（Mass Spectrometry）［7］，連接酶鏈反應(yīng)（Ligase Detection Reaction）［8］，基 因 芯 片［9］，SNPstream 技術(shù)［10］，分子燈塔技術(shù)［11］等。其中DNA 直接測(cè)序是傳統(tǒng)的序列測(cè)定的方法，但是其檢測(cè)靈敏度低，在對(duì)腫瘤組織、穿刺活檢組織或體液等不均一樣本進(jìn)行SNP突變檢測(cè)時(shí)具有較大局限性。雖然Pyrosequencing、熒光定量PCR、質(zhì)譜等方法具有較高的靈敏度，但這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備具有很高的要求，在簡單實(shí)驗(yàn)條件下的常規(guī)臨床檢測(cè)中很少能夠應(yīng)用。本研究建立了一種基于連接酶-凝膠電泳的簡便、快速、靈敏的SNP突變檢測(cè)方法，適合于在簡單實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測(cè)。并對(duì)在非小細(xì)胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑藥物個(gè)體化治療中的生物標(biāo)記基因表皮生長因子受體（EGFR）為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)有較高突變頻率的EGFR，c.2573T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分型檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從棗陽臨床學(xué)院腫瘤科62 例非小細(xì)胞肺癌血漿樣本中抽提循環(huán)DNA，-20 ℃保存。（1）檢測(cè)樣本：攜帶有野生型和突變型等位基因的EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP突變位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA 以黃杰等［12］定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。寡核苷酸探針：針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)，用3條寡核苷酸探針進(jìn)行檢測(cè)。分別為上游的兩條特異性檢測(cè)探針和下游的一條公用探針（圖1）。在兩條特異性探針的5′端，為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag1，3′端為與模板上突變位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的序列，并且3′末端堿基與突變位點(diǎn)堿基對(duì)應(yīng)互補(bǔ)，野生型檢測(cè)探針（WT-Probe）與野生型等位基因互補(bǔ)，突變型檢測(cè)探針（MT-Probe）與突變型等位基因互補(bǔ)，在特異性探針的5′端分別進(jìn)行生物素修飾。公用檢測(cè)探針5′端為與SNP位點(diǎn)另一側(cè)序列互補(bǔ)的序列，3′端為一段通用擴(kuò)增引物序列Tag2。對(duì)EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的探針序列，見表1。對(duì)檢測(cè)探針進(jìn)行通用擴(kuò)增的Tag1序列和Tag2的互補(bǔ)序列（CTag2）分別為：Tag1：5′-TTT TTT TGG GTT CGT GGT AGA GCG TCG GAG T-3′；CTag2：5′-CCA GAC GAC ACC GAG ATA GCA GCC-3′。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：Low MW DNA Marker-A 購自生工生物工程（上海）有限公司，2×PCR Mastermix購自天根生化科技北京有限公司，鏈親和素（Streptavidin）磁珠購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司，Taq DNA ligase購自New England BioLabs。TA 克隆試劑盒、TaKaRa Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）購自上海葉舟生物科技有限公司。核酸序列均由上海生工生物有限公司合成。其余試劑均為分析純。

圖1 檢測(cè)探針設(shè)計(jì)示意圖

表1 寡核苷酸檢測(cè)探針序列

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因擴(kuò)增對(duì)基因外顯子18和21進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為：exon 21-forward：5′-GAG CTT CTT CCC ATG ATG ATC T-3′；exon 21-reverse：5′-GAA AAT GCT GGC TGA CCT AAA G-3′；exon 18-forward：5′-GAG GTG ACC CTT GTC TCT GTG T-3′；exon 18-reverse：5′-CCC AAA CAC TCA GTG AAA CAA A-3′。擴(kuò)增體系為：3μL 循環(huán)DNA 樣本，0.5μmol／L擴(kuò)增引物，15μL 2×Taq PCR Mastermix，去離子水補(bǔ)足30μL。擴(kuò)增條件為：95°C 預(yù)變性4 min，95°C 變性30s，60°C 退火30s，72°C 延伸40s，35 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸4min。各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物用直接測(cè)序法測(cè)定突變類型。

1.2.2 連接反應(yīng) 針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)，用兩個(gè)檢測(cè)管進(jìn)行檢測(cè)，并分別標(biāo)記為WT 管和MT 管。兩管分別加入3μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，5μL 模板序列和1 U 的Taq ligase，在MT管中加入50fmol突變型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，WT 管中加入50fmol野生型特異性檢測(cè)探針和公用檢測(cè)探針，去離子水補(bǔ)足30μL。對(duì)于每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，設(shè)定一對(duì)照管CT，對(duì)照管中不加入模板序列，其它成分與檢測(cè)管相同。反應(yīng)條件為：94 ℃變性40s，60 ℃退火5min；5個(gè)循環(huán)；95℃變性5min。

1.2.3 純化反應(yīng) 按照Streptavidin 磁珠操作說明，對(duì)各SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)各管擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。加入20μL Tris-HCl（10mmoL，pH7.5）重新懸浮磁粒。

1.2.4 通用擴(kuò)增反應(yīng) 取15μL 2×PCR Mastermix，5μL各管對(duì)應(yīng)純化磁性微粒，2μmol／L 的通用擴(kuò)增引物Tag1 和CTag2，去離子水補(bǔ)足30μL。95℃預(yù)變性30s；95℃變性25 s，60℃退火45s，72℃延伸20s；20個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 分別取各SNP突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)MT 管、WT 管和CT 管擴(kuò)增產(chǎn)物5L 進(jìn)行3.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)3個(gè)反應(yīng)管對(duì)應(yīng)泳道在目標(biāo)位置電泳條帶出現(xiàn)的情況判定檢測(cè)突變位點(diǎn)基因型。如果WT 管和MT 管對(duì)應(yīng)泳道均出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為野生／突變型；如果只有WT 管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則該SNP位點(diǎn)為純合野生型；如果只有MT 管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)SNP為純合突變型。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)方法流程 通過連接反應(yīng)，WT 管中野生型檢測(cè)探針和公用探針能夠完成連接，而MT 管中突變型檢測(cè)探針和公用探針不能連接。經(jīng)鏈親和素磁性微粒的純化反應(yīng)，WT 管中完成連接反應(yīng)的探針被純化固定在鏈親和素磁性微粒上。以Tag1和CTag2作為通用引物，對(duì)WT 管和MT 管中磁性微粒純化產(chǎn)物進(jìn)行通用擴(kuò)增反應(yīng)，最后在瓊脂糖凝膠電泳水平對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)。通過觀察WT 管和MT 管對(duì)應(yīng)電泳泳道條帶的出現(xiàn)情況進(jìn)行結(jié)果判定。WT 管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)條帶，而MT 管對(duì)應(yīng)泳道無條帶，說明檢測(cè)SNP位點(diǎn)為野生純合子基因型。野生純合子SNP位點(diǎn)的檢測(cè)示意圖，見圖2。

圖2 分型方法檢測(cè)流程圖

2.2 連接溫度的優(yōu)化 進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，退火溫度是影響反應(yīng)靈敏度及特異性的一個(gè)重要因素，特異性會(huì)隨著退火溫度的升高而有所提高，但是較高的退火溫度也會(huì)使得退火效率降低從而影響檢測(cè)的靈敏度。以L858R 野生型質(zhì)粒模板為檢測(cè)對(duì)象，分別在55、60、65 ℃的退火溫度條件下，經(jīng)檢測(cè)探針的連接，純化和PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，在55、60 ℃兩個(gè)溫度梯度條件下，均明顯在WT 管對(duì)應(yīng)泳道出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而其余泳道均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)；但是當(dāng)退火溫度上升為65 ℃時(shí)，3個(gè)泳道均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。說明檢測(cè)探針在檢測(cè)模板上的退火能力隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，在55～60℃時(shí)能夠有效的保證檢測(cè)探針在檢測(cè)模板上的退火從而完成連接反應(yīng)。但是在65 ℃條件下，檢測(cè)探針無法有效的退火到模板上，使得連接反應(yīng)不易完成，從而無目的擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。因?yàn)樵趯?duì)檢測(cè)探針設(shè)計(jì)時(shí)，將所有檢測(cè)探針上H1、H2序列的Tm 值均設(shè)計(jì)為58～60℃，所以為了即能夠保證探針在模板上的有效退火，又能夠保證連接反應(yīng)的特異性，選定60 ℃作為連接反應(yīng)的溫度。

圖3 連接溫度的優(yōu)化

2.3 特異性檢測(cè) 通過擴(kuò)增反應(yīng)中的循環(huán)次數(shù)對(duì)本方法的特異性進(jìn)行檢測(cè)，分別對(duì)L858R 野生／突變混合模板和L861Q 、G719C兩個(gè)野生型等位基因模板進(jìn)行檢測(cè)。分別作20和30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，將各管5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物做3.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。兩種循環(huán)條件下，在L858R 位點(diǎn)的MT管和WT 管對(duì)應(yīng)泳道中均出現(xiàn)明顯擴(kuò)增條帶，而G719C 和L861Q 兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的WT 管泳道出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，MT 泳道均未有條帶出現(xiàn)。同時(shí)，3個(gè)位點(diǎn)對(duì)應(yīng)CT 管泳道均未出現(xiàn)條帶。說明此方法具有較高的檢測(cè)特異性和擴(kuò)增容量。

圖4 分型方法特異性檢測(cè)

2.4 敏感性檢測(cè) 以L858R 位點(diǎn)為檢測(cè)對(duì)象，分別設(shè)定突變等位基因在總檢測(cè)模板中的比例為50.00%、25.00%、5.00%、2.50%，對(duì)不同比例的混合等位基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，各條件下，在MT 和WT 管對(duì)應(yīng)的泳道中均有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，且隨著突變型等位基因所占比例的減少，MT 管對(duì)應(yīng)泳道中擴(kuò)增條帶亮度逐漸減弱，但當(dāng)突變等位基因在混合等位基因中比例低至2.50%時(shí)，仍能夠在MT 管對(duì)應(yīng)泳道中檢測(cè)出擴(kuò)增條帶，說明本方法有著較高的檢測(cè)靈敏度，適合于從不均一的樣本中對(duì)突變等位基因進(jìn)行檢測(cè)。

圖5 L858R 位點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳水平敏感度檢測(cè)

2.5 樣本檢測(cè) 利用本方法對(duì)62 例樣本中EGFR，c.2573 T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A（L861Q）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，并與直接測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了比較。兩種方法未檢測(cè)到L861Q 和G719C 位點(diǎn)的突變，但均檢測(cè)到L858R 位點(diǎn)有雜合子突變。如圖6所示，通過直接測(cè)序方法僅可以明確檢測(cè)出8＃和15＃兩例樣本是L858R 位點(diǎn)雜合子突變，23＃樣本出現(xiàn)類似雜峰的突變堿基對(duì)應(yīng)峰，故無法給出明確的基因型判斷。而通過連接酶-瓊脂糖凝膠電泳方法共檢測(cè)出8＃，15＃，23＃，6＃，11＃，14＃共6例樣本是L858R 雜合子突變（圖7）。結(jié)果證明，連接酶-瓊脂糖凝膠電泳方法比直接測(cè)序方法具有更高的靈敏度，適合于對(duì)不均一樣本或雜合子突變位點(diǎn)的檢測(cè)。

圖6 循環(huán)DNA 樣本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位點(diǎn)突變測(cè)序圖

圖7 樣本EGFR，c.2573T＞G（L858R）位點(diǎn)突變檢測(cè)圖

3 討 論

隨著人類生物信息學(xué)資源的爆炸性積累，極大地推動(dòng)了SNP突變檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。但是，SNP 突變檢測(cè)技術(shù)在檢測(cè)成本、靈敏性和常規(guī)性等方面仍需要進(jìn)行改進(jìn)。如傳統(tǒng)的DNA 直接測(cè)序方法的靈敏度只有20%［13-14］，檢測(cè)位點(diǎn)突變等位基因?qū)?yīng)測(cè)定峰線很低，無法明確從背景峰中分離（圖6），因此，不能夠從不均一樣本中對(duì)突變等位基因進(jìn)行檢測(cè)。雖然實(shí)時(shí)定量PCR、焦磷酸測(cè)序，以及質(zhì)譜等檢測(cè)方法的靈敏度較高，文獻(xiàn)報(bào)道稱可達(dá)到1%［14-15］，但是這些檢測(cè)方法都要求具備昂貴的檢測(cè)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)試劑，因而不能夠在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行突變檢測(cè)，限制了其在基層醫(yī)療或研究機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。

本研究建立的SNP突變檢測(cè)方法基于連接酶反應(yīng)原理，通過檢測(cè)探針的連接反應(yīng)，鏈親和素磁性微粒對(duì)連接探針的純化反應(yīng)以及通用擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)，利用瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行SNP突變位點(diǎn)的分型檢測(cè)。本方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，能夠從野生／突變位點(diǎn)所在混合質(zhì)粒模板中檢測(cè)出低至2.50%的突變型等位基因，因此，適合于從不均一樣本中對(duì)突變等位基因進(jìn)行檢測(cè)。而且，與其他檢測(cè)方法如熒光定量PCR，質(zhì)譜，DNA 直接測(cè)序等方法相比，本方法操作簡單，不需要借助昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，只需普通PCR 儀、凝膠電泳等簡單實(shí)驗(yàn)條件即能完成，同時(shí)，所需探針長度均小于50bp，合成成本低，沒有對(duì)熒光探針等昂貴試劑及高質(zhì)量檢測(cè)樣本的要求，具有較低的實(shí)驗(yàn)成本和易操作性，因此，更適合于在常規(guī)、簡單實(shí)驗(yàn)條件下的突變檢測(cè)。

本方法較高的檢測(cè)特異性通過以下條件保證：（1）在設(shè)計(jì)檢測(cè)探針時(shí)，除了依靠特異性檢測(cè)探針3′端堿基與突變堿基的配對(duì)識(shí)別能力外，還在其3′端上游第3個(gè)堿基處引入1個(gè)錯(cuò)配堿基以增強(qiáng)探針的識(shí)別能力；（2）特異性檢測(cè)探針和公用探針的H1和H2序列的Tm 值與通用擴(kuò)增引物Tag1 和Tag2序列的Tm 值相差7～8度，以減少連接反應(yīng)和后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)之間的影響；（3）高保真性Taq DNA 連接酶對(duì)錯(cuò)配堿基的識(shí)別作用。本方法同時(shí)具有較高檢測(cè)靈敏度，其是通過在探針序列上設(shè)計(jì)通用擴(kuò)增引物序列Tag1和Tag2，完成連接反應(yīng)后，進(jìn)行了連接產(chǎn)物的二次擴(kuò)增以極大增加連接產(chǎn)物的數(shù)量，從而能夠在瓊脂糖凝膠電泳水平進(jìn)行快速檢測(cè)。但瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)靈敏度具有局限性，因此，當(dāng)突變等位基因在不均一樣本總的比例低至2.50%時(shí)，就不能夠得以檢測(cè)。同時(shí)，在檢測(cè)通量上也有限制，不適合于進(jìn)行高通量的突變檢測(cè)。

綜上所述，本研究建立了一種基于連接酶-凝膠電泳的SNP分型新方法，并對(duì)與酪氨酸激酶抑制劑個(gè)體化用藥密切相關(guān)的EGFR 基因的3個(gè)常見SNP位點(diǎn)EGFR，c.2582T＞A（L861Q），EGFR，c.2573T＞G（L858R）和EGFR，c.2155G＞T（G719C）進(jìn)行了檢測(cè)。該方法操作簡便，有較高的檢測(cè)特異性和靈敏度，適合于在一般實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)不均一樣本進(jìn)行常規(guī)突變檢測(cè)。

［1］ Kathryn MM.Factors influencing warfarin dose requirements in African-Americans［J］.Phamacogenomics，2007，8（11）：1535-1545.

［2］ 張博，陳潔平.microRNA 相關(guān)基因rs895819、rs6505162和rs2292832的SNP變異與B細(xì)胞淋巴瘤患者生存關(guān)系的研究［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（16）：1801-1803.

［3］ 王春俠，林加娟，劉宣宣，等.海門山羊MDFI基因SNP及其與體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2013（9）：99-104.

［4］ 王倩，羅凱.一種EGFR 基因突變檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2014，43（11）：1351-1356.

［5］ 黃小英，王超，黃炳臣，等.XRCC4與XPC 編碼區(qū)突變與肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)性研究［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，33（8）：1085-1088.

［6］ 王丹慧，蔡彥寧，張燕莉，等.異檸檬酸脫氫酶D 基因突變焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（2）：219-224.

［7］ Mauger F，Gelfand DH，Gupta A，et al.High-specificity single-tube multiplex genotyping using Ribo-PAP PCR，tag primers，alkali cleavage of RNA／DNA chimeras and MALDI-TOF MS［J］.Hum Mutat，2013，34（1）：266-273.

［8］ Pingle M，Rundell M，Das S，et al.PCR／LDR／universal array platforms for the diagnosis of infectious disease［J］.Methods Mol Biol，2010，632（1）：141-157.

［9］ 馬芬，吳鳳霞，李寧，等.應(yīng)用Affymetrix全基因組芯片檢測(cè)染色體7q36區(qū)域的DNA 拷貝數(shù)突變［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2009，26（3）：336-339.

［10］ 費(fèi)麗娟，季林丹，張莉娜，等.SNPstream 基因分型技術(shù)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012，29（1）：9-12.

［11］ 劉小琦.采用SNaPshot方法對(duì)中國老年黃斑變性與C2和C3基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)性研究［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）：285-287.

［12］ 黃杰，曲守方，徐任，等.人類EGFR 基因突變體質(zhì)控品的建立［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1758-1763.

［13］ Garcia CA，Ahmadian A，Gharizadeh B，et al.Mutation detection by pyrosequencing：sequencing of exons 5-8of the p53tumor suppressor gene［J］.Gene，2000，253（2）：249-257.

［14］ Dufort S，Richard MJ，de Fraipont F.Pyrosequencing method to detect KRAS mutation in formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissues［J］.Anal Biochem，2009，391（2）：166-168.

［15］ Jarry A，Masson D，Cassagnau E，et al.Real-time allelespecific amplification for sensitive detection of the BRAF mutation V600E［J］.Mol Cell Probes，2004，18（5）：349-352.