范原銘，侯 婧，董 寧，王 強(qiáng)，顧 敏

（1.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院普外科 401220；2.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 401220；3.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)婦幼保健院外科 401220）

乳腺癌作為威脅我國(guó)婦女生命健康的頭號(hào)腫瘤殺手，由于其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，故越來(lái)越成為眾多學(xué)者關(guān)注和研究的重點(diǎn)。而隨著對(duì)腫瘤的研究深入，“腫瘤干細(xì)胞”的理論應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤干細(xì)胞是指一小部分具有自我更新以及多向分化潛能，并且具有極強(qiáng)的成瘤能力的腫瘤細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可以不斷分化、增殖出新的腫瘤細(xì)胞，具有了無(wú)限增殖以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。本文擬利用人乳腺癌無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法獲得具有腫瘤干細(xì)胞特性的人乳腺癌細(xì)胞微球體（mammospheres，MSs），并通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)了解MSs所具有的生物學(xué)特性，以期為MSs應(yīng)用于乳腺癌干細(xì)胞研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM-F12、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、上皮特異性抗原EDA、紅細(xì)胞裂解液（鼎國(guó)生物公司）；BALB／c雌性裸鼠（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；高速離心機(jī)（日立公司）；2.5μL及20.0μL Gilson移液器（吉爾森公司）；24孔板（鼎國(guó)生物公司）。本實(shí)驗(yàn)在重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 方法

1.2.1 MSs的培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于含有生長(zhǎng)因子的DMEM-F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方包含1∶50B27，20ng／mL EGF，20ng／mL bFGF。在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。每3天換液1次，2 000r／min離心5 min，收集細(xì)胞后半量換液及全量換液交替進(jìn)行。在MSs形成后每5～7天傳代1次，傳代時(shí)2 000r／min離心5min，收集MSs。胰酶消化5min后吹打至MSs消失，從而終止消化，獲取微球體細(xì)胞（mammospheres-derived cells，MSDCs），離心收集細(xì)胞，繼續(xù)上述無(wú)血清培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將MSs用胰酶消化成MSDCs，移液器取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MSDCs約30 萬(wàn)個(gè)，用適量培養(yǎng)基將其配制成13mL細(xì)胞懸液。將MSDCs細(xì)胞懸液加入24孔板的中間兩排，每孔1mL。24孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。次日觀(guān)察到細(xì)胞開(kāi)始貼壁后，用移液器沿24孔板中間直線(xiàn)劃痕。培養(yǎng)液沖洗掉劃下的細(xì)胞，加入DMEM-F12無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按第0、24、48小時(shí)拍照記錄。同時(shí)選取MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照（MCF-7組）。

1.2.3 transwell實(shí)驗(yàn) 胰酶將MSs消化成單細(xì)胞，加入培養(yǎng)基配制成5×106／mL的細(xì)胞懸液。transwell上室膜上每孔加入200μL MSDCs懸液，下室每孔加入500μL無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，取出上室擦去表層細(xì)胞，90%乙醇固定30min，自然晾干。結(jié)晶紫染色20 min后顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞通過(guò)情況。設(shè)MCF-7組為對(duì)照。

1.2.4 動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn) 將MSs消化成單細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋為2×103／mL的懸液。1mL注射器（7號(hào)針頭）將其種植于裸鼠的左側(cè)背部皮下，每只裸鼠注射0.1mL。同時(shí)采用2×106／mL MCF-7細(xì)胞懸液種植于同一裸鼠的右側(cè)背部作為對(duì)照。本組實(shí)驗(yàn)共接種6只裸鼠，分別編為Ⅰ～Ⅵ號(hào)。接種后動(dòng)物均放置于動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。接種7d后連續(xù)觀(guān)察成瘤情況。1個(gè)月后處死動(dòng)物并取出移植瘤進(jìn)行石蠟包埋切片及HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSs的培養(yǎng) 在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)第5 天后可以觀(guān)察到有MSs的形成。在培養(yǎng)第10 天時(shí)觀(guān)察到MSs球體變大，且邊緣出現(xiàn)明顯的折光帶。培養(yǎng)第15天時(shí)MSs球體體積停止增長(zhǎng)，此時(shí)球體結(jié)構(gòu)最為緊密。在將MSs進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)可以看到，新生成的MSs球體較之前有所變小，且結(jié)構(gòu)較為松散，周?chē)休^多的單個(gè)細(xì)胞。在傳代培養(yǎng)2代后無(wú)法形成新的MSs。見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MSDCs進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSs組細(xì)胞遷徙速度較快，在24h后可以看到劃痕帶處已經(jīng)有細(xì)胞出現(xiàn)，并且劃痕帶較前變窄。48h后劃痕帶已愈合，充滿(mǎn)大量細(xì)胞，且與MSDCs形態(tài)一致。MCF-7組在24h后劃痕帶處未見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)，48h后劃痕帶未愈合。見(jiàn)圖2。

圖1 MSs的培養(yǎng)情況（普通光學(xué)顯微鏡×100）

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)照片（普通光學(xué)顯微鏡×40）

2.3 transwell實(shí)驗(yàn) 在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)出每個(gè)視野的細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值。MSs 組中可見(jiàn)到（76.24±0.35）個(gè)細(xì)胞，而MCF-7組中為（17.38±0.18）個(gè)（P＜0.05）。MSs具有比MCF-7細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲能力，見(jiàn)圖3。

2.4 動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn) 在接種第11天時(shí)可以觀(guān)察到Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ號(hào)裸鼠的右側(cè)背部出現(xiàn)移植瘤，而在接種第18天時(shí)觀(guān)察到僅有Ⅴ號(hào)裸鼠的左側(cè)背部出現(xiàn)移植瘤。接種MSs后14d時(shí)6只小鼠均可觀(guān)察到移植瘤的出現(xiàn)且隨著時(shí)間推移瘤體逐漸增大，在21d后瘤體生長(zhǎng)速率加快。而MCF-7組一側(cè)在21d時(shí)僅有2組小鼠出現(xiàn)移植瘤，且移植瘤生長(zhǎng)速率相對(duì)較慢，見(jiàn)圖4～5。

圖3 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)（transwell×100）

圖4 裸鼠成瘤結(jié)果

圖5 移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3 討 論

近年來(lái)大量的研究證明，腫瘤細(xì)胞中有一小部分具有多向分化潛能及自我更新能力的細(xì)胞。這與人類(lèi)造血干細(xì)胞的特性相一致，因此有學(xué)者將其命名為腫瘤干細(xì)胞。其中包括乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。乳腺癌干細(xì)胞的分選培養(yǎng)與證實(shí)現(xiàn)已成為眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。流式細(xì)胞技術(shù)磁性激活細(xì)胞分選法以及SP 細(xì)胞富集分選法已被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞分選培養(yǎng)的重要手段［1-5］。

CD44＋CD24-與ALDH1＋被認(rèn)為是乳腺癌干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記物［6］。Phillip等［7］采用無(wú)血清懸浮法從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中獲得了一種可能含有乳腺癌干細(xì)胞的乳腺球，其中CD44＋CD24-細(xì)胞的比例為40.3%。董華英等［8］利用非黏附性乳腺球懸浮培養(yǎng)法從原代培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞中得到了具有腫瘤干細(xì)胞特性的乳腺癌細(xì)胞MSDCs。并且通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)所獲得的MSDCs中乳腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物ALDH1＋比例較高，而ALDH1＋與所選病例的化療次數(shù)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從MCF-7細(xì)胞中獲得了MSs，且MSs的培養(yǎng)時(shí)間及球體形態(tài)與上述學(xué)者的研究相符。因此，作者認(rèn)為無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可用于實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的分選培養(yǎng)。

腫瘤細(xì)胞所具有的無(wú)限增殖與遠(yuǎn)處侵襲是導(dǎo)致腫瘤臨床治療失敗的主要原因。而腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)正是具有極強(qiáng)的侵襲及體外成瘤能力［9-12］。Kim 等［13］在對(duì)胰腺膽道腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)：表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD133＋的細(xì)胞具有較強(qiáng)的遠(yuǎn)處遷移及侵襲能力，這類(lèi)細(xì)胞并且具有較強(qiáng)的化療耐藥性。Han等［14］從MCF-7細(xì)胞獲得了MSs，檢測(cè)其中N-cadherin、vimentin、a-SMA 等的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)MSDCs細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化活躍。而這種變化可能導(dǎo)致了MSs具有了較強(qiáng)的侵襲能力。動(dòng)物體內(nèi)成瘤是檢驗(yàn)?zāi)[瘤干細(xì)胞特性的一項(xiàng)重要手段。Yeh等［15］發(fā)現(xiàn)肺癌干細(xì)胞具有極強(qiáng)的體外成瘤能力，且移植瘤中高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD44＋及CD133＋。如果加入三氟拉嗪則可抑制其動(dòng)物致瘤能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSs在成瘤速度及移植瘤體積方面均強(qiáng)于MCF-7細(xì)胞，且HE 染色結(jié)果符合腫瘤診斷。因此作者認(rèn)為MSs在遠(yuǎn)處遷移、侵襲性生長(zhǎng)及動(dòng)物成瘤方面具有較強(qiáng)的能力，這與腫瘤干細(xì)胞的特性相符合。因此推測(cè)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)所獲得的MSs具有腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性，但需要通過(guò)下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深入的研究加以證明。

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