肖玉娟 何少貴 林慧霞

有效微生物活菌總數(shù)檢測(cè)技術(shù)研究

肖玉娟 何少貴 林慧霞

有效微生物，英文名Effective Microorganisms，?？s寫為EM，是日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授在20世紀(jì)80年代初期研究成功的一種由5科10屬80種微生物復(fù)合而成的多功能微生態(tài)制劑[1]。EM菌可在使用處形成良好的微生態(tài)環(huán)境，在種植[2]、畜牧[3,4]、水產(chǎn)[5]、飼料[6]以及人體保健[7]等方面，尤其是環(huán)境修復(fù)方面有重要的應(yīng)用[8～12]。

EM制劑中活菌總數(shù)是影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素，因此，對(duì)EM菌中活菌總數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)有重要的意義。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)EM制劑活菌總數(shù)的有效檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)際操作中多采用GB 4789.2系列《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法。而EM制劑菌群組成復(fù)雜，各種微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境條件及其生長(zhǎng)速度差異較大，國(guó)標(biāo)法在EM制劑活菌總數(shù)檢測(cè)中的適用性有待考察。本文在GB 4789.2-2010的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和優(yōu)化了EM菌活菌總數(shù)的平板計(jì)數(shù)法，并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

材料與方法

1.材料

(1)EM菌：江西益生生物技術(shù)有限公司提供，其中液體樣4個(gè)，編號(hào)1,2,3,4；粉劑樣2個(gè)，編號(hào)5,6。糖蜜：江西益生生物技術(shù)有限公司提供。

(2)培養(yǎng)基[13]

平板計(jì)數(shù)瓊脂 (g/L)：胰蛋白胨5；酵母浸膏2.5；葡萄糖1；瓊脂15。

2.樣品檢測(cè)

方法同GB 4789.2-2010，其中為防止培養(yǎng)基干枯，每塊平板加入培養(yǎng)基25-30ml，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)72h的平板以保鮮膜密封，防止水分過(guò)度蒸發(fā)。

3.檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)

4.影響因素的考察

以GB 4789.2-2010的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為出發(fā)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基為平板計(jì)數(shù)瓊脂，初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)糖蜜的添加可顯著提高檢出的菌落數(shù)，因此，本論文對(duì)糖蜜的添加量及培養(yǎng)基初始pH值，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了考察。確定一項(xiàng)最優(yōu)條件后，后續(xù)試驗(yàn)均按前面的優(yōu)化值來(lái)進(jìn)行。

結(jié)果與分析

1.培養(yǎng)基中糖蜜濃度的影響

糖蜜為EM菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分，營(yíng)養(yǎng)豐富，EM菌中的大部分菌株均可利用糖蜜生長(zhǎng)繁殖，對(duì)國(guó)標(biāo)法中的計(jì)數(shù)瓊脂可起到良好的補(bǔ)充作用。但糖蜜顏色較深，添加量過(guò)大時(shí)培養(yǎng)基透光度低，易造成漏檢，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%這五個(gè)水平的糖蜜添加量(V/V)進(jìn)行考察，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

圖1 糖蜜濃度對(duì)報(bào)告率的影響

從圖1中可以看出，添加糖蜜至培養(yǎng)基中后，EM菌的報(bào)告率提高顯著；且試驗(yàn)中可觀察到大部分菌落均顯著變大，易于觀察。糖蜜濃度低于1.0%時(shí)，報(bào)告率隨糖蜜濃度的升高而上升，大于1.0%時(shí)報(bào)告率基本保持穩(wěn)定，平均值略有降低，原因可能是：①平板檢測(cè)法本身存在一定的誤差，實(shí)驗(yàn)組數(shù)為6時(shí)并不能完全消除其誤差；②糖蜜濃度的升高使培養(yǎng)基顏色加深，部分較小的菌落被漏檢。選擇添加1.0%的糖蜜至平板計(jì)數(shù)瓊脂中效果較優(yōu)。

2.培養(yǎng)基初始pH值的影響

添加糖蜜后的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基初始pH值約為5.0 (糖蜜濃度差異影響不顯著)。由于EM菌中各菌株間的最適生長(zhǎng)pH值可能存在差異，同時(shí)，pH值的調(diào)節(jié)可能對(duì)糖蜜中的營(yíng)養(yǎng)成分造成影響，因此本實(shí)驗(yàn)中使用磷酸鹽緩沖液[13]對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，考察了培養(yǎng)基初始pH值為5.0,6.0,7.0,8.0時(shí)檢出菌落數(shù)的差異，結(jié)果如圖2所示。

圖2 初始pH值對(duì)報(bào)告率的影響

圖2結(jié)果顯示，培養(yǎng)基初始pH值低于7.0時(shí)，平均檢出率隨pH值的升高而略有降低，pH值從7.0上升至8.0時(shí)，平均檢出率顯著下降。原因可能有：①EM菌中大部分菌株在pH值5.0～7.0的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，pH值5.0為其較適生長(zhǎng)值；②在實(shí)驗(yàn)中觀察到隨著pH值的上調(diào)，培養(yǎng)基顏色略有加深，這可能是糖蜜中部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨pH值上升而變性，不利于微生物生長(zhǎng)。因此，實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基的初始pH值為5.0最佳。

3.培養(yǎng)溫度的影響

鑒于EM菌中各菌株的最適生長(zhǎng)溫度可能存在差異，本論文對(duì)培養(yǎng)溫度為25℃,30℃，36℃，40℃時(shí)的菌落檢出率和平均報(bào)告率進(jìn)行分析，培養(yǎng)溫度的影響如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)報(bào)告率的影響

從圖3中可以看出，培養(yǎng)溫度在25℃～36℃之間時(shí)，平均報(bào)告率隨溫度的升高而顯著上升，溫度升高至40℃時(shí)，平均報(bào)告率顯著下降，表明培養(yǎng)溫度對(duì)報(bào)告率影響較大，以36℃為宜。

4.培養(yǎng)時(shí)間的影響

EM菌中部分處于休眠狀態(tài)和生長(zhǎng)速度較慢的菌株在48h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)不能形成肉眼可見(jiàn)的菌落，常導(dǎo)致漏檢。實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間為48h，72h，96h下的菌落數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。不同培養(yǎng)時(shí)間的報(bào)告率如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)報(bào)告率的影響

從圖4中可以看出，培養(yǎng)時(shí)間從48h延長(zhǎng)至72h時(shí)，平均報(bào)告率得到有效提升(17.5%)，且大部分菌落直徑顯著變大，計(jì)數(shù)容易。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至96h時(shí)，平均報(bào)告率僅提高1.7%，而培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基水分過(guò)度蒸發(fā)，需要將平板密封，增加了實(shí)驗(yàn)操作并延長(zhǎng)報(bào)告時(shí)間，因此，72h為較合適培養(yǎng)時(shí)間。

5.與國(guó)標(biāo)法的效果比較

圖5為同一樣品相同稀釋度下使用國(guó)標(biāo)法與本研究計(jì)數(shù)法的檢測(cè)平板結(jié)果圖；其中左側(cè)平板為GB 4789.2-2010計(jì)數(shù)平板，右側(cè)為實(shí)驗(yàn)改良計(jì)數(shù)平板。

圖5 檢測(cè)效果對(duì)照

結(jié)果表明：在培養(yǎng)基糖蜜濃度為1.0%，初始pH值自然，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h的改良平板上，菌落較大，計(jì)數(shù)容易，菌落數(shù)多，EM菌檢出率顯著高于國(guó)標(biāo)法。

結(jié)語(yǔ)

EM菌劑中菌種組成復(fù)雜，GB 4789.2-2010中的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件難以滿足其中大部分微生物的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)需求。添加糖蜜能夠起到有效的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充作用，選擇1%(V/V)糖蜜培養(yǎng)基，初始pH值自然，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h能夠有效地提高EM菌劑中的菌落檢出率，該條件下檢出的菌落數(shù)為GB 4789.2-2010方法檢出菌落數(shù)的8.05～14.66倍，展示出顯著的改進(jìn)效果和適用性能。

（作者單位：廈門華廈學(xué)院）

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[13]GB 4789.2-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定[S]

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