陳 軍，羅德珍，李鏡友，張志堅(jiān)，任錦文，沈 藝

（1．廣州市花城制藥廠，廣東 廣州 510555； 2．廣東省從化市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510900）

高效液相色譜雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定猴耳環(huán)消炎片中沒(méi)食子酸和槲皮苷含量

陳 軍1，羅德珍2，李鏡友1，張志堅(jiān)1，任錦文1，沈 藝1

（1．廣州市花城制藥廠，廣東 廣州 510555； 2．廣東省從化市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510900）

目的建立同時(shí)測(cè)定猴耳環(huán)消炎片中沒(méi)食子酸和槲皮苷含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法采用HPLC雙波長(zhǎng)法，以Hypersil BDS-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m）為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、0．2%磷酸為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，沒(méi)食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，槲皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。結(jié)果沒(méi)食子酸及槲皮苷進(jìn)樣量分別在0．60～6．00 g，0．03～0．30 g(r=0．999 4)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；沒(méi)食子酸平均回收率為100．24%，RSD為1．02%（n=6）；槲皮苷平均回收率為99．88%，RSD為1．17%（n=6）。結(jié)論HPLC雙波長(zhǎng)法簡(jiǎn)便可行、重復(fù)性好，適用于猴耳環(huán)消炎片2種有效成分的同時(shí)測(cè)定，可用于猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；猴耳環(huán)消炎片；沒(méi)食子酸；槲皮苷

猴耳環(huán)消炎片(糖衣片)為猴耳環(huán)藥材單味制劑，具有清熱解毒、涼血消腫等功效[1]。本品主要含沒(méi)食子酸、槲皮苷和聯(lián)苯三酚[2-4]等成分。而沒(méi)食子酸、槲皮苷是猴耳環(huán)消炎、止咳的主要有效成分[5]。另外，沒(méi)食子酸還有抗菌、抗病毒[6]和抗腫瘤[7]作用。猴耳環(huán)消炎片部頒標(biāo)準(zhǔn)和局頒標(biāo)準(zhǔn)中均只有沒(méi)食子酸的薄層色譜鑒別，無(wú)法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中選擇沒(méi)食子酸、槲皮苷作為主要檢測(cè)指標(biāo)，并首次建立高效液相色譜（HPLC）雙波長(zhǎng)法，用于同時(shí)測(cè)定猴耳環(huán)消炎片中沒(méi)食子酸和槲皮苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-10AD型高效液相色譜儀，SPD-M20A型PDA檢測(cè)器，LC-Solution工作站（日本島津公司）。對(duì)照品沒(méi)食子酸（批號(hào)為110831-200803）和槲皮苷（批號(hào)為 111538-200403）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；猴耳環(huán)消炎片（廣州市花城制藥廠，批號(hào)為20110317，20110422，20110435）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:A為乙腈，B為0．2%磷酸水溶液，梯度洗脫(見(jiàn)表1)；流速:1 mL／min；柱溫:室溫；檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm（沒(méi)食子酸）、350 nm (槲皮苷)；進(jìn)樣量：10 μL。各待測(cè)組分分離度均大于1．5，理論板數(shù)均不低于3 000。

表1 梯度洗脫條件表

2．2 溶液制備

精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸和槲皮苷對(duì)照品適量，用甲醇配成含沒(méi)食子酸0．30 g／L、槲皮苷15 μg／mL的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品除去包衣，研細(xì)，取0．4 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈-0．2%磷酸（25∶75）50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：根據(jù)處方及生產(chǎn)工藝制備缺猴耳環(huán)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液，取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液2，4，8，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，沒(méi)食子酸為Y= 5．292×106X-3．007×105(r=0．999 4)，槲皮苷為Y=2．593× 106X-7．514×103(r=0．999 4)。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸、槲皮苷進(jìn)樣量分別在0．60～6．00 μg和0．03～0．30 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果，沒(méi)食子酸和槲皮苷峰面積的 RSD分別為 1．40%和0．93%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20110317），按擬訂方法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果，沒(méi)食子酸和槲皮苷平均含量分別為45．66 mg／g和1．06 mg／g，RSD分別為0．53%和0．93%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品（批號(hào)為20110317）溶液，按擬訂色譜條件分別于0，4，8，12，24，36，48 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，沒(méi)食子酸和槲皮苷峰面積的 RSD分別為0．78%和0．65%（n=7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（批號(hào)為20110317，分別含沒(méi)食子酸和槲皮苷45．66 mg／g和1．06 mg／g）約0．25 g，精密稱(chēng)定，共6份，置具塞錐形瓶中，加入相應(yīng)量的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液（6．02 g／L）2 mL和槲皮苷對(duì)照品溶液（0．28 g／L）1 mL，按供試品溶液制備方法制備待測(cè)溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1-2 高效液相色譜圖（350 mm）

圖1-1 高效液相色譜圖（270 mm）

表2 沒(méi)食子酸和槲皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2．4 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品各3份，按擬訂方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果批號(hào)為20110317，20110422，20110435的樣品中沒(méi)食子酸的含量分別為 45．60，45．12，45．12 mg／g，RSD分別為0．24%，0．88%，0．64%（n=3）；槲皮苷的含量分別為 1．04，1．05，1．15 mg／g，RSD分別為0．82%，1．21%，0．91%（n=3）。

3 討論

取沒(méi)食子酸與槲皮苷甲醇溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)間進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果沒(méi)食子酸在（215±2）nm和（270±2）nm波長(zhǎng)處有最大吸收，槲皮苷在（256±2）nm和（350±2）nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與文獻(xiàn)[5，8]所收載的紫外吸收波長(zhǎng)一致。為了排除相互的干擾，選用270 nm作為沒(méi)食子酸檢測(cè)波長(zhǎng)，350 nm作為槲皮苷檢測(cè)波長(zhǎng)。

用甲醇、乙腈-0．2%磷酸（25∶75）、水-甲醇-乙腈（450∶50∶1）、乙腈-磷酸鹽緩沖液等作溶劑，對(duì)溶劑的量、超聲時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果用乙腈-0．2%磷酸（25∶75）作為溶劑，超聲處理20 min最理想。

猴耳環(huán)藥材中鞣質(zhì)類(lèi)成分在煎煮過(guò)程中水解為沒(méi)食子酸，隨著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，沒(méi)食子酸含量呈上升趨勢(shì)[9]。但實(shí)際生產(chǎn)工藝中煎煮時(shí)間如何確定，還應(yīng)進(jìn)行更多的沒(méi)食子酸熱分解和動(dòng)力學(xué)研究[10]。

[1]WS3-B-1248-92．衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第六冊(cè))·猴耳環(huán)消炎片[S]．

[2]王永剛，淡 墨，李詠華，等．猴耳環(huán)化學(xué)成分的研究[J]．中藥材，2005，28(9)：774-775．

[3]蘇妙賢，唐之岳，黃偉歡，等 ．猴耳環(huán)化學(xué)成分研究[J]．中藥材，2009，32(5)：705-707．

[4]張志堅(jiān)，李鏡友，李國(guó)強(qiáng)．猴耳環(huán)研究進(jìn)展[J]．中國(guó)藥業(yè)，2010，19（18）: 82-84．

[5]柯銘清．中草藥有效成分理化與藥理特性[M]．第2版．長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1982：105-106，233．

[6]江紀(jì)武，肖慶祥．植物藥有效成分手冊(cè)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：479．

[7]季宇彬，張廣美．中草藥抗腫瘤有效成分藥理與應(yīng)用[M]．哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1998：239．

[8]陳德昌．中藥化學(xué)對(duì)照品工作手冊(cè)[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002：106．

[9]朱詩(shī)塔，李新中，雷 鵬，等．不同煎煮法對(duì)大黃沒(méi)食子酸含量的影響及與小腸推進(jìn)作用的相關(guān)性[J]．中南藥學(xué)，2008，6（6）：714-717．

[10]郭滿滿，肖卓炳，彭密軍，等．沒(méi)食子酸的熱穩(wěn)定性研究[J]．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2012，32（4）：58-62．

Content Determination ofGallicAcid and Quercitrosidein Houerhuan Xiaoyan Pills by HPLC Dual Wavelength Method

Chen Jun1,Luo Dezhen2,Li Jingyou1,Zhang Zhijian1,Ren Jinwen1,Shen Yi1
（1．Guangzhou Huacheng Pharmaceutical Factory,Guangzhou,Guangdong,China 510555; 2．Conghua Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou,Guangdong,China 510900）

Objective To establish an HPLC method for simultaneous detection of Gallic acid and Quercitroside in Houerhuan Xiaoyan Pills．Methods The HPLC dual wavelength spectrophotometry was used with Hypersil BDS-C18(250 mm×4．6 mm,5 μm)column;with acetonitrile as mobile phase A,0．2% phosphoric acid as mobile phase B,for gradient elution;the detection wavelength of gallic acid was 270 nm;the detection wavelength of quercitroside was 350 nm．Results The linear relations were good of gallic acid in the range of 0．60-6．00 μg(r=0．999 4)and quercitroside in the range of 0．03-0．30 μg(r=0．999 4);the average recovery of gallic acid was 100．24%,RSD 1．02%（n=6）;the average recovery of quercitroside was 99．88%,RSD 1．17%（n=6）．Conclusion HPLC dual wavelength determination is simple and feasible,with good reproducibility,is suitable for the simultaneous determination of the active ingredients in Houerhuan Xiaoyan Pills,and can be used for quality control of Houerhuan Xiaoyan Pills．

HPLC;Houerhuan Xiaoyan Pills;gallic acid;quercitroside

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2015)21-0129-02

2015-01-27；

2015-06-24)