魏雅蕾，蔡 偉，張志超，楊玉琴，李廣雷，昶國(guó)平，劉博 ，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

天麻提取物灌胃給予大鼠后入血成分研究

魏雅蕾，蔡 偉，張志超，楊玉琴，李廣雷，昶國(guó)平，劉博 ，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的確證天麻入血成分信息。方法大鼠禁食12 h，灌胃給藥，給藥量為 2 mL／100 g，固相萃取(SPE)法進(jìn)行血漿處理，運(yùn)用HPLC-LTQ-Orbitrap MS法對(duì)進(jìn)入大鼠血液的天麻化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果共檢測(cè)到10種入血成分。結(jié)論除了天麻苷，天麻中還有對(duì)羥基苯甲醛、3，4-二羥基苯甲醛、p-ethoxymethylphenyl-1-O- -glucopyranoside、羥基芐基-1-O- -D-吡喃葡萄糖、鄰苯二甲酸二甲酯、4，4′-二羥基二芐基醚、4，4′-二羥基二苯基甲烷、天麻醚苷、2-乙氧基-4-甲基苯酚進(jìn)入血液，均為酚性化合物及其苷類(lèi)。

天麻；化學(xué)成分；HPLC-LTQ-Orbitrap MS；碎片離子

天麻 Gastrodia elata Bl．為蘭科植物天麻的干燥塊莖，又名赤箭、定風(fēng)草等，主產(chǎn)于我國(guó)西南地區(qū)[1-3]，其性味甘平，歸肝經(jīng)，具有止痙、息風(fēng)、平肝、祛風(fēng)的作用，治療眩暈、頭痛、中風(fēng)、偏癱以及其他神經(jīng)性疼痛效果顯著[4-6]。近年來(lái)，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其不可比擬的高靈敏度和選擇性，可快速獲得豐富的信息量，廣泛應(yīng)用于藥物定性和定量分析、結(jié)構(gòu)鑒定和代謝轉(zhuǎn)化等研究[7-9]。目前，天麻入血成分尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)天麻進(jìn)入血液的化學(xué)成分進(jìn)行分析，為后續(xù)天麻的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究和體內(nèi)藥效學(xué)、代謝研究奠定了基礎(chǔ)[10-11]。

1 儀器與試藥

Accela 600 pump型高效液相色譜儀與 LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI），Xcalibur 2．1工作站（美國(guó) Thermo Scientific公司）；Sartorius CP225D型(萬(wàn)分之一)天平；DZ-2BC型烘箱(天津市麥斯特儀器有限公司)；B-220型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；KQ5200E型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters高效液相色譜儀(Waters 1525泵，Waters 2489UV檢測(cè)器)。甲醇（色譜純，批號(hào)為148671，F(xiàn)isher公司，）；天麻苷（批號(hào)為K01016CB14，上海源葉生物科技有限公司）；天麻購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為 Gastrodia elata Bl．的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2．1 動(dòng)物與給藥方案

SPF級(jí) SD雄性大鼠10只，體重250～280 g，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)為 SCXK＜京＞2012-0001），屏障環(huán)境飼養(yǎng)1周，給藥前禁食12 h。取90 g天麻飲片，10倍量50%乙醇回流提取2 h，減壓濃縮，蒸干，水復(fù)溶，作為試驗(yàn)用藥。試驗(yàn)組（5只）每只給藥量為每100 g體重2 mL，空白組（5只）給予等量生理鹽水。

2．2 樣品處理

試驗(yàn)組大鼠給藥后0，0．5，1，2，4 h于眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血，血液置加入肝素鈉的EP管中，4℃，4 500 r／min離心10 min，合并上清液。血漿樣品用固相萃取(SPE)小柱除血漿蛋白，合并洗脫液，于30℃水浴中通氮?dú)饬鲹]干，殘?jiān)尤?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，4℃，10 000 r／min離心15 min，取上清液10 μL進(jìn)樣。空白血漿樣品處理方法相同。

2．3 檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為T(mén)hermo C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，B為水，梯度洗脫(條件見(jiàn)表1)；流速為1 mL／min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫條件

質(zhì)譜條件：LC／MS LTQ Orbitrap耦合ESI源，電噴霧離子源在負(fù)離子模式下運(yùn)行，參數(shù)為電壓3 kV，毛細(xì)管溫度350℃，鞘氣30 arb，輔助氣 10 arb，精確相對(duì)分子質(zhì)量采用外質(zhì)量校準(zhǔn)法（＜1．0×10-6）。

2．4 檢測(cè)結(jié)果

空白血漿、給藥后大鼠血漿樣品按2．2項(xiàng)下方法處理后，空白血漿、天麻提取物、給藥后大鼠血漿按2．3項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)，總離子流（TIC）圖見(jiàn)圖1。通過(guò)與空白血漿、天麻提取物的比較，根據(jù)各種物質(zhì)的分子質(zhì)量、保留時(shí)間、離子碎片可以推測(cè)有10種成分進(jìn)入血液，見(jiàn)表2。

圖1 TIC圖

表2 天麻進(jìn)入大鼠血漿中的10種化學(xué)物質(zhì)

3 討論

通過(guò)與提取物中化學(xué)成分的準(zhǔn)分子離子峰、保留時(shí)間、離子碎片比較，給藥大鼠血漿樣品中共檢測(cè)出10個(gè)化合物。除天麻苷外，還有9種化學(xué)成分進(jìn)入血液，均為天麻化學(xué)成分中的酚性化合物及其苷類(lèi)。在負(fù)離子模式下，酚酸類(lèi)成分及一級(jí)質(zhì)譜中都產(chǎn)生豐度較高的準(zhǔn)離子峰[M-H]-；而在 MS2中，酚酸類(lèi)成分會(huì)產(chǎn)生[M-H-H2O]-、[M-H-CO]-等碎片離子，是由于其含有羥基和特征基團(tuán)的原因。本研究初步確立了天麻的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為以后制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]王相美，紀(jì)麗娜．天麻的鑒定與藥理分析研究[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8(11):39．

[2]孫澤陽(yáng)，胡東鳴．天麻及其活性成分藥效作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)野生植物資源，2012，31(3):1-7．

[3]金 虹，李 鳳，段 寧．天麻提取物工藝及其功效成分含量的分析[J]．中藥材，2009，32(5):799-802．

[4]杜慶波．天麻藥理活性與臨床應(yīng)用研究新進(jìn)展[J]．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34(16):2 434．

[5]鄒 寧，呂劍濤，薛仁余，等．天麻素對(duì)小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(4):807-809．

[6]程 剛，好修華，劉國(guó)梁，等．天麻素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J]．中藥學(xué)雜志，2003，38(2):127-129．

[7]羅永東，林培玲，吳水生，等．應(yīng)用ASE-LC-ESI-MS法快速篩選腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2011(7):29-31．

[8]唐瑰寶，陳 楠，潘 馨．液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在黃酮類(lèi)化合物研究中的應(yīng)用[J]．海峽藥學(xué)，2011(23):7-9．

[9]張海江，袁日琴，胡靜雅．復(fù)方丹參片中三七皂苷成分組成的SPEHPLC-MS法測(cè)定[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011(22):2 174-2 176．

[10]魏元鋒，林 曉，張 寧，等 ．大川芎效應(yīng)組分血中移行成分UPLC-MS分析[J]．中國(guó)中藥雜志，2011，36(8):1 245-1 248．

[11]鄭秀艷，陳華國(guó)，周 欣，等．基于入血成分的天麻藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26(6):1 355-1 357．

Constituents in Rat Plasma after Oral Administration of the Extract of Gastrodia Elata Bl．

Wei Yalei,Cai Wei,Zhang Zhichao,Yang Yuqin,Li Guanglei,Chang Guoping,Liu Boxuan,Zhang Honggui
（College of Chinese Medicine,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing,China 100102）

Objective To obtain the constituents ofGastrodia elata Bl．in rat plasma．M ethods The rats were fasted 12 h before administration,and the orally dose was 2 mL／100 g．The plasma samples were pre-treated with C18solid-phase extraction(SPE) method．The constituents in rat plasma were analyzed by HPLC-LTQ-Orbitrap MS．Results A total of 10 constituents were detected．Conclusion In addition to gastrodin,3,4-dihydroxybenz aldehyde,p-hydroxybenzaldehyde,dimethyl phthalate,gastrodeoside,2-ethoxy-4-methylphenol,p-ethoxymethylphenyl-1-O-β-glucopyranoside,4-hydroxybenzyl-β-D-glucopyranoside,4,4′-dihydroxydibenzyl ether and 4,4′-dihydroxydibenzyl methane are into blood as well,they are phenolic compounds and glycosides．

Gastrodia elata Bl．;constituent;HPLC-LTQ-Orbitrap MS;fragment ions

R285.5；R282.71

A

1006-4931(2015)21-0008-03

魏雅蕾，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲魉幯邪l(fā)和藥物體內(nèi)吸收與代謝，（電子信箱）wei_yalei2013＠163．com。

2015-03-04)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：31070328。