申麗莎，陳國慶，楊 帆，鄧開英

（1．重慶市中藥研究院，重慶 400061； 2．重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121； 3．重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

高效液相色譜法波長切換法同時(shí)測(cè)定吳茱萸中3組分含量

申麗莎1，陳國慶1，楊 帆2，3，鄧開英2，3

（1．重慶市中藥研究院，重慶 400061； 2．重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121； 3．重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121）

目的建立同時(shí)測(cè)定吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱堿和吳茱萸次堿含量的高效液相色譜（HPLC）波長切換法。方法色譜柱為C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流動(dòng)相為乙腈-0．2%磷酸溶液（35∶65），流速為2．0 mL／min，柱溫為30℃，波長切換（0～15 min，205 nm；15．01～28 min，225 nm）。結(jié)果吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿進(jìn)樣量分別在0．186～3．72 g，0．040 24～0．804 8 g，0．040 08～0．801 6 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0．999 7，0．999 9，0．999 9)，平均回收率分別為96．30%，97．66%，97．46%，RSD分別為1．43%，1．32%，1．80%（n=6）。結(jié)論該法簡便，快速準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于吳茱萸藥材的質(zhì)量控制。

吳茱萸；吳茱萸內(nèi)酯；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；高效液相色譜法；含量測(cè)定

吳茱萸為常用中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效，主治厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉，外治口瘡、高血壓[1-3]。吳茱萸藥材中的吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿是其主要的3個(gè)活性成分[4]，故建立高靈敏度、干擾少、精密度高及處理簡單的測(cè)定3種成分的檢測(cè)方法十分必要。2010年版《中國藥典（一部）》[5]和文獻(xiàn)[6-9]中，分別采用乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸和乙腈-庚烷磺酸鈉溶液等為流動(dòng)相、225 nm波長檢測(cè)吳茱萸藥材中3組分的含量。還有研究報(bào)道，采用甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫后225 nm波長同時(shí)檢測(cè)3組分的含量[10]。此類方法雖能同時(shí)測(cè)定 3組分，但其流動(dòng)相組成較復(fù)雜或含緩沖鹽，對(duì)色譜柱和儀器系統(tǒng)不利，且吳茱萸內(nèi)酯在225 nm波長處響應(yīng)低，靈敏度不夠。故本試驗(yàn)中建立了以乙腈-0．2%磷酸為流動(dòng)相，以205 nm波長檢測(cè)吳茱萸內(nèi)酯、225 nm波長檢測(cè)吳茱萸堿和吳茱萸次堿的高效液相色譜(HPLC)法，色譜峰分離良好，基線平穩(wěn)，各成分響應(yīng)靈敏，可為吳茱萸的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國），HP-Chmestation色譜工作站；BP211S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Simplicity-185型超純水機(jī)（美國Millipore公司）；KQ500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。吳茱萸內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為110800-200203）、吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)為110802-200504）和吳茱萸次堿對(duì)照品（批號(hào)為110801-200505）均購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸飲片（重慶慈晟藥業(yè)有限公司、重慶市中藥飲片廠有限公司和重慶鑫斛藥房連鎖有限公司各1批），經(jīng)重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院楊帆副主任藥師鑒定，均為蕓香科植物吳茱萸 Evodia rutaecarpa（Juss．）Benth．的干燥果實(shí)；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zobax SB C18柱（250 mm4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0．2%磷酸溶液（35∶65）；流速：2．0 mL／min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長切換：0～15 min時(shí)205 nm，15．01～28 min時(shí)225 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，樣品色譜峰分離良好，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．2 溶液制備

稱取吳茱萸內(nèi)酯對(duì)照品23．25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中；精密稱取吳茱萸堿10．06 mg、吳茱萸次堿10．02 mg，精密稱定，分置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液；分別精密量取上述3種對(duì)照品溶液各1 mL，置同一5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取吳茱萸樣品，粉碎，過3號(hào)篩，取粉末0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡1 h，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2．2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1，5，10，15，20 μL，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（C,μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=319．61 C-23．644，r= 0．999 6；A=4 704．6 C-17．892，r=0．999 9；A=2 551．9 C-10．306，r=0．999 9。結(jié)果表明，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿進(jìn)樣量分別為0．186～3．72 μg、0．040 24～0．804 8 μg、0．040 08～0．801 6 μg時(shí)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液 10 μL，連續(xù)進(jìn)樣 5次。結(jié)果，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的 RSD分別為1．1%，0．9%，1．3%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，依法制備供試品溶液各5份，測(cè)定含量。結(jié)果，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的 RSD分別為1．5%，1．6%，2．0%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取新制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL。結(jié)果，吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的 RSD分別為1．0%，0．3%，1．1%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同批樣品0．25 g 6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 3組分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2．4 樣品含量測(cè)定

按擬訂方法測(cè)定3批吳茱萸樣品的含量。結(jié)果3批樣品吳茱萸內(nèi)酯含量分別為20．6，10．2，5．4 mg／g；吳茱萸堿含量分別為 19．8，2．1，15．7 mg／g；吳茱萸次堿的含量分別為13．1，1．8，8．7 mg／g。

3 討論

本試驗(yàn)中采用2010年版《中國藥典（一部）》吳茱萸藥材項(xiàng)下含量測(cè)定方法，以80%乙醇作為提取溶劑，經(jīng)浸泡后再超聲提取，基本能將樣品中的待測(cè)成分提取完全。

本試驗(yàn)中簡化了流動(dòng)相，在保證各成分分離效果的基礎(chǔ)上，可減少對(duì)儀器和色譜柱的損傷。流動(dòng)相考察中，比較了乙腈-水、乙腈-0．1%磷酸、乙腈-0．2%磷酸不同溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明以乙腈-0．2%磷酸為流動(dòng)相，各峰分離度好。

分別采用205 nm檢測(cè)吳茱萸內(nèi)酯、225 nm檢測(cè)吳茱萸堿和吳茱萸次堿，可使3組分分別達(dá)到較好的響應(yīng)值，靈敏度更高。經(jīng)DAD檢測(cè)，樣品中3組分色譜峰與對(duì)應(yīng)的對(duì)照品紫外光譜一致。

[1]戴媛媛，劉保林，竇昌貴．吳茱萸及其有效成分的藥理研究進(jìn)展[J]．中藥材，2003，26（4）：295．

[2]龔慕辛，王智民，張啟偉，等．吳茱萸有效成分的藥理研究進(jìn)展[J]．中藥新藥與臨床藥理，2009，20（2）：183．

[3]楊云云，郭 惠，王昌利．吳茱萸生物堿及其主要成分吳茱萸次堿藥理研究進(jìn)展[J]．中藥藥理與臨床，2010，26（5）：182．

[4]姚 迪，孫晶晶，劉 雷，等．LC-MS／MS法測(cè)定大鼠血漿中的吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯及其生物利用度的研究[J]．華西藥學(xué)雜志，2014，29（3）：298．

[5]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：282．

[6]何詠梅，田 靜，鄧 晶．HPLC法同時(shí)測(cè)定吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿與吳茱萸內(nèi)酯的含量[J]．中國藥房，2012，23（31）：2 944．

[7]宋亞芳，王智民，朱晶晶，等．一測(cè)多評(píng)法測(cè)定吳茱萸中吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量[J]．中國中藥雜志，2009，34（21）：2 781．

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[10]蘇娟娟，張 璐，何明珍，等．HPLC同時(shí)測(cè)定吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的含量[J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，21（6）：53．

SimultaneousDeterminationof3Componentsin EuodiaeFructusbyHPLC Wavelength Switching Technology

Shen Lisha1，Chen Guoqing1，Yang Fan2,3,Deng Kaiying2,3
(1．Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing,China 400061; 2．Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing,China 401121； 3．Chongqing Engineering Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing,China 401121)

Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of 3 components in Euodiae Fructus．M ethods A C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used with the mobile phase of acetonitrile-0．2% phosphoric acid(35∶65)with the flow rate of 2．0 mL／min and the column temperature was 30℃．The detection wavelength was set at 205 nm for Evodine in the first 15．01 min, and then changed to 225 nm for evodiamine and rutaecarpine between 15．01 and 28 min．Results The linear ranges of evodine,evodiamine and rutaecarpine fell within the ranges of 0．186～3．72 μg,0．040 24～0．804 8 μg,0．040 08～0．801 6 μg,respectively (r=0．999 7，0．999 9，0．999 9)．The average recoveries were 96．30%,97．66% and 97．46% with RSD were 1．43%,1．32% and 1．80%,respectively（n=6）．Conclusion The method is convenient，quick，accurate and suitable for the qulity control of Euodiae Fructus．

Euodiae Fructus;Evodine;Evodiamine;Rutaecarpine;HPLC;wavelength switching;determination

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2015)21-0115-03

申麗莎，女，藥師，主要從事中藥生產(chǎn)與質(zhì)量檢測(cè)工作，（電子信箱）shenlisa＠163．com；鄧開英，女，主任藥師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量控制，本文通訊作者，（電子信箱）dengkaiying6811＠sina．com。

2015-07-23；

2015-10-27)

重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：cstc2012jjA10154。