李家立　李平　馬洪皓　白芳芳　田辰　郝騰　趙利　朱國(guó)東

連夏配方顆粒對(duì)心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA、酪氨酸激酶受體A mRNA表達(dá)的影響

李家立李平馬洪皓白芳芳田辰郝騰趙利朱國(guó)東

【摘要】目的觀察連夏配方顆粒對(duì)心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)mRNA、酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor A，TrKA)mRNA表達(dá)的影響。方法將90只清潔級(jí)健康7周齡Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心梗模型組、美托洛爾組、連夏配方顆粒高、中、低劑量(189.00、94.50、47.25 mg/kg)組。各組均結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支以復(fù)制心肌梗死大鼠模型，假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。假手術(shù)與心梗模型組大鼠予生理鹽水，余各組予相應(yīng)實(shí)驗(yàn)藥物；連續(xù)灌胃給藥30天，采用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)心梗周圍區(qū)NGF mRNA、TrKA mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，心梗模型組大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織NGF mRNA、TrKA mRNA表達(dá)均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，連夏配方顆粒高、中、低劑量組大鼠心梗周圍區(qū)NGF mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；連夏配方顆粒高、中劑量組大鼠心梗周圍區(qū)TrKA mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒高劑量組大鼠心梗周圍區(qū)NGF mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論連夏配方顆?？娠@著降低心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織NGF mRNA、TrKA mRNA的表達(dá)，達(dá)到改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)自主神經(jīng)重構(gòu)的作用。

【關(guān)鍵詞】連夏配方顆粒；心肌梗死；自主神經(jīng)重構(gòu)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；酪氨酸激酶受體A

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)作為最先被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)發(fā)育的作用[1-3]。而酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor A, TrkA)可激活多個(gè)胞內(nèi)信號(hào)通路參與NGF介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)元分化存活以及神經(jīng)元特性的維持等諸多過程,是NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要信號(hào)蛋白[2-6]。

本研究通過復(fù)制心肌梗死大鼠模型，連續(xù)灌胃給予實(shí)驗(yàn)藥物，旨在觀察中藥小復(fù)方連夏配方顆粒(組名中簡(jiǎn)稱連夏)對(duì)心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)NGF mRNA、TrKA mRNA表達(dá)的影響，探討連夏配方顆粒對(duì)心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)自主神經(jīng)重構(gòu)的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康7周齡Wistar雄性大鼠90只，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證：SCXK(京)2009-0007。

1.2主要藥品與試劑

連夏配方顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司。酒石酸美托洛爾片，阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：1103070C。UltraSYBR Mixture(With ROX)(CW0956)、超純RNA提取試劑盒(CW0581)、DNase 1(CW2090)、5xRNA Loading Buffe(CW0611A)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(CW0744)等均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3主要儀器

分光光度計(jì)(NANODROP 2000, Therno scientific)、渦旋振蕩儀(QL-902, 海門其林貝爾儀器公司)、熒光定量PCR儀(ABI7500, Applied Biosystems)、離心機(jī)(Centrifuge 5415D, Eppendorf)等。

1.4分組與給藥

將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心梗模型組、美托洛爾組、連夏高、中、低劑量(189.00、94.50、47.25 mg/kg)組，每組15只。假手術(shù)組、心梗模型組大鼠分別予0.9%生理鹽水10 mL/kg灌胃，美托洛爾組大鼠予美托洛爾100 mg/kg灌胃，連夏配方顆粒高、中、低劑量組大鼠分別給予相應(yīng)劑量連夏配方顆粒灌胃；模型建立的當(dāng)天即灌胃給藥；每天給藥1次，連續(xù)進(jìn)行30天；每天每只大鼠0.9%生理鹽水的灌胃量均為10 mL/kg。最終每組取3只大鼠進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.5模型復(fù)制

大鼠模型復(fù)制采用手術(shù)結(jié)扎法[7]，經(jīng)用3.5%水合氯醛10 mL/kg劑量腹腔麻醉，仰臥固定大鼠后，于左側(cè)第4、5肋間切口，打開胸腔、心包，輕壓胸廓擠出心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，后立即將心臟放回，關(guān)閉切口，縫合皮膚，局部應(yīng)用青霉素防感染。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。

1.6取材與指標(biāo)檢測(cè)

給藥30天后進(jìn)行取材：腹腔麻醉，取心梗周圍相同區(qū)域心肌組織，迅速放入液氮降溫后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用Real-time RT-PCR方法進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)：取心肌組織100 mg，用RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，取總RNA 1 μL以紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度、濃度，計(jì)算OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0之間視為純度較高、完整性較好，否則重新提取RNA，并計(jì)算總RNA濃度。按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，引物序列見表1。用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書及文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行。

表1　引物序列

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1對(duì)心肌組織NGF mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，心梗模型組大鼠心肌梗死周圍區(qū)心肌組織NGF mRNA明顯升高(P<0.01)。給藥30天后，與心梗模型組比較，美托洛爾組大鼠NGF mRNA明顯降低(P<0.01)；連夏配方顆粒高、中、低劑量組大鼠NGF mRNA均明顯降低(P<0.01)。與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒高劑量組大鼠NGF mRNA明顯降低(P<0.05)。說明連夏配方顆?？梢燥@著改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織NGF mRNA的表達(dá)，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

組別 NGFmRNA假手術(shù)組(n=3) 0.51±0.06心梗模型組(n=3) 1.49±0.16a美托洛爾組(n=3) 0.97±0.04ab連夏高劑量組(n=3) 0.78±0.09abc連夏中劑量組(n=3) 0.96±0.04ab連夏低劑量組(n=3) 1.09±0.12ab

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與心梗模型組比較，bP<0.01；與美托洛爾組比較，cP<0.05

2.2對(duì)心肌組織TrKA mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，心梗模型組大鼠心肌梗死周圍區(qū)心肌組織TrKA mRNA明顯升高(P<0.01)。給藥30天后，與心梗模型組比較，美托洛爾組大鼠TrKA mRNA明顯降低(P<0.01)；連夏配方顆粒高、中劑量組大鼠TrKA mRNA均明顯降低(P<0.01)。與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒高劑量組大鼠TrKA mRNA無明顯變化(P>0.05)。說明連夏配方顆?？梢悦黠@改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織TrKA mRNA表達(dá)，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3討論

NGF是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，包括α、β、γ三個(gè)亞基，其中的β亞基則是NGF的活性亞單位，發(fā)揮NGF的全部生物學(xué)效應(yīng)。NGF可以促進(jìn)感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元的存活及分化，參與損傷修復(fù)，維持神經(jīng)元生物學(xué)功能的穩(wěn)定；對(duì)此在控制神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活和再生等方面研究較為廣泛[2-3, 10]。研究指出，除外源性NGF，心肌細(xì)胞也可以自主合成并分泌NGF。它在心肌受損后立刻被釋放到相應(yīng)部位，促進(jìn)心臟神經(jīng)的生長(zhǎng)及受損去甲腎上腺素能神經(jīng)元的再生，因此可能參與心肌梗死后心臟自主神經(jīng)失支配、再生和過度支配過程，進(jìn)而與心肌梗死后致命性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[11-13]。

表3各組大鼠心肌組織TrKA mRNA表達(dá)的影響

組別TrKAmRNA假手術(shù)組(n=3)0.68±0.04心梗模型組(n=3)1.92±0.07a美托洛爾組(n=3)0.95±0.05ab連夏高劑量組(n=3)0.86±0.04ab連夏中劑量組(n=3)1.27±0.07abc連夏低劑量組(n=3)1.89±0.10ac

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.01；與心梗模型組比較,bP<0.01；與美托洛爾組比較,cP<0.01

TrkA是NGF的高親和力受體，與NGF具有較高的親和力；它是一種由TrkA原癌基因表達(dá)的、具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白[2, 4-5, 14]，其下游通路主要包括有絲分裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路、PI3K/Akt通路和PLCγ通路等[3, 6, 10, 15]。TrKA一般介導(dǎo)正性信號(hào)，與到目前為止研究仍不明確、主要介導(dǎo)負(fù)性信號(hào)的NGF低親和力受體p75受體(p75 NTR)一起調(diào)控著神經(jīng)生長(zhǎng)、存活和分化[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥小復(fù)方連夏配方顆?？梢燥@著降低心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心肌組織NGF和TrKA兩者的mRNA表達(dá)水平。研究顯示，連夏配方顆粒之所以能夠顯著改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區(qū)心臟交感神經(jīng)與迷走神經(jīng)的再生重構(gòu)[18]，其作用機(jī)制可能與連夏配方顆?？梢杂行Ы档托募」Ｋ乐車鷧^(qū)心肌組織NGF mRNA與TrKA mRNA表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：黃凡)

·論著·

作者單位：100069首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[鄒大威、高彥彬、李嬌陽(碩士研究生)、周盛楠(碩士研究生)、王馨瑤(碩士研究生)、龔慕辛、耿建國(guó)、王金羊(博士研究生)、朱智耀、張娜(博士研究生)]；中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[鄒大威、高彥彬、李嬌陽(碩士研究生)、周盛楠(碩士研究生)、王馨瑤(碩士研究生)、龔慕辛、耿建國(guó)、王金羊(博士研究生)、朱智耀、張娜(博士研究生)]

Effects ofLianXiaFormula Granule on NGF mRNA and TrKA mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarctionLIJia-li,LIPing,MAHong-hao,etal.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of LianXia Formula Granule (LXFG) on NGF mRNA、TrKA mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarction (MI). MethodsNinty healthy male Wistar rats were randomly assigned to six groups: sham operated group, model group, metoprolol group, high, middle and low-dose of LXFG group (189.00, 94.50, 47.25 mg/kg). The sham operated rats were not ligated in the left anterior descending coronary artery except the rest groups. The sham operated group and model group were given with normal saline by intragastric administration, and the rest groups were given with medicine for testing. 30 days later, NGF mRNA, TrKA mRNA expression level were separately measured in all groups. ResultsCompared with the model group, NGF mRNA expression level in the high, middle and low-dose of LXFG group decreased (P<0.01) and TrKA mRNA expression level in the high and middle-dose of LXFG group decreased (P<0.01). Compared with the metoprolol group, NGF mRNA expression level in the high-dose of LXFG group decreased (P<0.05). ConclusionApplication of LianXia Formula Granule in rats after MI can significantly decrease the expression level of NGF mRNA、TrKA mRNA to improve cardiac autonomic neural remodeling.

【Key words】LianXia Formula Granule;Myocardial Infarction;Cardiac Autonomic Neural Remodeling;Nerve growth factor;Tyrosine kinase receptor A

通訊作者：高彥彬(1959- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥研究。E-mail：dfyynfm@163.com

作者簡(jiǎn)介：鄒大威(1982- )，女，博士，講師。研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥研究。E-mail：5362559@qq.com

基金項(xiàng)目：北京市教育委員會(huì)首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)面上項(xiàng)目(13ZY07)

(收稿日期：2015-01-26)

Corresponding author:LI Ping, E-mail: pearll2008@126.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.010