彭平　孫道涵　馮朵　趙麗敏　楊書(shū)娟　朱乃亮　張璐　李煥娟　折改梅　石任兵

失眠模型下女貞子紅景天苷制備物藥代動(dòng)力學(xué)分析研究

彭平孫道涵馮朵趙麗敏楊書(shū)娟朱乃亮張璐李煥娟折改梅石任兵

【摘要】目的闡明女貞子紅景天苷制備物作為治療失眠病癥藥物的藥代動(dòng)力學(xué)表征特性。方法采用超高效液相色譜法，PDA檢測(cè)器，ACQUITY UPLC H-CLASS T3 色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈—水(3∶97)，流速0.3 mL/min；柱溫25 ℃。結(jié)果失眠模型下，入血成分紅景天苷Cspan20.24 μg/mL、Tspan0.5 h、T1/22.53 h、K0.27，酪醇Cspan0.49 μg/mL、Tspan0.75 h，血藥濃度比值(酪醇∶紅景天苷)最大值為3.90∶100，為體外含量比值的12.58倍。結(jié)論在失眠模型下，女貞子紅景天苷制備物體內(nèi)主要入血成分為紅景天苷和酪醇，且表征出藥代協(xié)同性；與正常狀態(tài)比較，表現(xiàn)出體內(nèi)成分生物利用度增加的藥物親和性。

【關(guān)鍵詞】紅景天苷；酪醇；藥代動(dòng)力學(xué)；失眠；親和性

紅景天苷、酪醇為中藥紅景天的特性功效性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，紅景天苷具有調(diào)節(jié)睡眠周期，抗失眠的藥理活性，可作為失眠病癥治療藥物[1-3]。為了解決紅景天的資源缺乏狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)組發(fā)明并建立了從女貞子藥材中提取，并經(jīng)堿轉(zhuǎn)化后，大孔樹(shù)脂分離富集制備紅景天苷的方法，所得女貞子紅景天苷制備物(簡(jiǎn)稱：制備物)以自然藥學(xué)觀為指導(dǎo)，經(jīng)藥物體系研究導(dǎo)向制備而來(lái)[4-9]。為探尋其藥物自然性、協(xié)同性、親和性[10-11]，本實(shí)驗(yàn)組前期研究建立了超高效液相色譜法，PDA檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定紅景天苷和酪醇的體內(nèi)分析方法(體內(nèi)紅景天苷、酪醇的最低檢測(cè)濃度分別為0.5 μg/mL、0.25 μg/mL，最低定量濃度分別為1 μg/mL、0.5 μg/mL，平均回收率分別為90.97%、92.33%)，發(fā)現(xiàn)了制備物在正常狀態(tài)大鼠體內(nèi)可同時(shí)檢出紅景天苷和酪醇兩成分，測(cè)其在正常大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)表征為：紅景天苷最大血藥濃度值(Cmax)為19.29 μg/mL、最大血藥濃度時(shí)間(Tmax)0.5 h、半衰期(T1/2) 3.28 h、曲線下面積(AUC0-t)21.00 μg/mL*h、平均滯留時(shí)間(MRT)3.43 h清除率K為0.21，酪醇最大血藥濃度值(Cmax)為0.32 μg/mL最大血藥濃度時(shí)間(Tmax)0.75 h，體內(nèi)同存酪醇與紅景天苷血藥濃度比值(以紅景天苷為參比)最大為2.99∶100，為制備物樣品含量比值的9.65倍。在藥代動(dòng)力學(xué)-成分相互作用(PK-DI)關(guān)聯(lián)研究中還發(fā)現(xiàn)了制備物中以紅景天苷與酪醇為主要有效成分的有關(guān)藥物體系在偏頭痛模型下表現(xiàn)出藥代協(xié)同吸收性。

本文研究在PCPA致大鼠失眠模型下女貞子紅景天苷制備物藥代動(dòng)力學(xué)表征，并同時(shí)與正常狀態(tài)下的藥代表征對(duì)比分析結(jié)果，以闡明其作為治療失眠病癥藥物的藥代動(dòng)力學(xué)表征特性，發(fā)現(xiàn)藥物與病理模型之間的特性表征，為進(jìn)一步基于本制備物進(jìn)行抗失眠的藥物創(chuàng)新提供科學(xué)依據(jù)。

1材料

1.1儀器

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器，Empower工作站，自動(dòng)進(jìn)樣；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)，METTLER TOLEDO XS204分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)，METTLER TOLEDO XP26分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)，sigma 1-14小型臺(tái)式離心機(jī)(sigma，德國(guó))，Labconco(r) CentriVap離心濃縮儀(LABCONCO，美國(guó))，渦旋混合器(其林貝爾，中國(guó))，0.22 μm微孔濾器。

1.2藥品與試劑

紅景天苷對(duì)照品(北京方程生物科技有限公司，批號(hào)130426；含量99.9%)、水楊苷對(duì)照品(北京方程生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)121118；含量99.9%)、酪醇對(duì)照品(北京方程生物科技有限公司，批號(hào)120927；含量99.9%)、高氯酸(分析純，天津市鑫源化工有限公司)、色譜乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)、哇哈哈純凈水、對(duì)氯苯丙氨酸(批號(hào)：C6506，SIGMA)。

女貞子紅景天苷制備物：取女貞子藥材(浙江產(chǎn)地)70%乙醇提取，經(jīng)堿轉(zhuǎn)化后，大孔樹(shù)脂分離富集制備而得。(批次：20130926，由課題組制備，樣品經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，紅景天苷含量64.5%，酪醇含量0.2%)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawley(SD)，雌性，大鼠，體質(zhì)量200～220 g，鼠齡6～8周，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001，批號(hào)20131021。

2方法

2.1給藥方案與樣品采集

SD大鼠隨機(jī)分為14組(分別為14個(gè)取血時(shí)間點(diǎn)組)，每組5只，采用腹腔注射PCPA劑量300 mg/kg致大鼠失眠模型，連續(xù)注射造模7天，于末次注射PCPA后30分鐘灌胃給藥女貞子紅景天苷制備物。

失眠模型大鼠，采用單次灌胃給藥女貞子紅景天苷制備物，給藥劑量60 mg/kg，于給藥后2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)腹主動(dòng)脈取血，每次5 mL，10000 r/min離心15分鐘，分離血清，即為含藥血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2血藥濃度測(cè)定方法

血樣處理方法：取300 μL含藥血清，置于2 mL離心管內(nèi)，準(zhǔn)確加入50 μL濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)水楊苷溶液，渦旋30秒，加0.4 mol/mL高氯酸180 μL，渦旋30秒，靜置15分鐘，14800 r/min高速離心15分鐘，取上清液200 μL加1 μL 50%NaOH調(diào)pH到6～7，過(guò)0.22 μm微孔濾器，供UPLC-PDA檢測(cè)分析。

2.3液相色譜分析條件

液相色譜條件Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器，Empower工作站，ACQUITY UPLC H-CLASS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈—水(3∶97)，流速為0.3 mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣體積為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。

3結(jié)果

3.1失眠模型下紅景天苷制備物藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果

取各給藥組血清樣品制備測(cè)定，計(jì)算失眠模型大鼠給藥后各時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)紅景天苷、酪醇的血藥濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　失眠模型大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)體內(nèi)

擬合失眠模型大鼠給藥紅景天苷制備物后體內(nèi)入血成分藥—時(shí)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　失眠模型大鼠給藥紅景天苷制備物后　體內(nèi)入血成分藥-時(shí)曲線

采用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件PKsolver計(jì)算得各給藥組體內(nèi)紅景天藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表2。

3.2藥代動(dòng)力學(xué)-成分相互作用(PK-DI)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

由表2可知，失眠模型下紅景天苷制備物給藥后，體內(nèi)成分紅景天苷Tmax為0.5 h，由體內(nèi)酪醇成分血藥濃度值分析可知體內(nèi)成分酪醇Tmax為0.75 h；在失眠狀態(tài)下，紅景天苷和酪醇兩成分的體內(nèi)Tmax值基本一致，體內(nèi)酪醇與紅景天苷成分有一定共血藥時(shí)間，可產(chǎn)生相互作用藥動(dòng)學(xué)協(xié)同吸收特性。

表2　失眠大鼠體內(nèi)紅景天苷成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3.3紅景天苷及酪醇體內(nèi)外含量相對(duì)比值分析

以紅景天苷含量為參比，計(jì)算體內(nèi)外制備物中成分酪醇含量與紅景天苷含量比值(體外含量比例為：酪醇含量/紅景天苷含量；體內(nèi)濃度比值為：酪醇血藥濃度/紅景天苷血藥濃度)以表征制備物體內(nèi)外藥物體系組成，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　失眠模型大鼠體內(nèi)外紅景天苷與酪醇含量比值

結(jié)果顯示，以紅景天苷含量為參比，酪醇與紅景天苷含量比值排序?yàn)椋褐苽湮矬w外<體內(nèi)0.25小時(shí)<體內(nèi)0.5小時(shí)<體內(nèi)0.75小時(shí)<體內(nèi)1小時(shí)；在大鼠體內(nèi)酪醇與紅景天苷含量比值較制備物增大了7.13～12.58倍，且從給藥后0.25小時(shí)到1小時(shí)持續(xù)了0.75小時(shí)的增量動(dòng)態(tài)變化。

4討論

4.1不同狀態(tài)下藥代動(dòng)力學(xué)-成分(PK-DI)相互作用關(guān)聯(lián)比較分析結(jié)果

紅景天苷制備物在失眠模型下與正常狀態(tài)下大鼠體內(nèi)成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較分析，設(shè)正常狀態(tài)下制備物組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為1，計(jì)算分別兩組體內(nèi)紅景天苷、酪醇成分藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比值(失眠模型組∶正常狀態(tài)組)可知，體內(nèi)成分紅景天苷：Tmax(0.5、0.5)比值為1∶1，即失眠組=正常組，Cmax(20.24、19.29)比值為1.05∶1，即失眠組>正常組，AUC0-t(28.31、21.00)比值為1.35∶1，即失眠組>正常組，清除率K(0.27、0.21)比值為1.29∶1，即失眠組>正常組，T1/2(2.53、3.28)比值為0.77∶1，即失眠組<正常組，MRT(2.80、3.43)比值為0.82∶1，即失眠組<正常組；體內(nèi)成分酪醇：Tmax(0.75、0.75)比值為1∶1，即失眠組=正常組，Cmax(0.49、0.32)比值為1.53∶1，即失眠組>正常組；分析表明在失眠模型下紅景天苷制備物藥物體內(nèi)紅景天苷和酪醇成分生物利用度均較正常狀態(tài)下高，體內(nèi)代謝速度較快。

4.2不同狀態(tài)下紅景天苷及酪醇體內(nèi)外含量相對(duì)比值分析

結(jié)果顯示，以紅景天苷含量為參比，酪醇與紅景天苷含量比值(3.90∶100)，明顯大于前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果：正常狀態(tài)下最大比值(2.99∶100)，且從給藥后15分鐘到1小時(shí)持續(xù)了45分鐘的增量動(dòng)態(tài)變化，失眠模型下體內(nèi)同存酪醇與紅景天苷血藥濃度比值可見(jiàn)失眠狀態(tài)下體內(nèi)酪醇與紅景天苷成分共血藥時(shí)間較正常狀態(tài)下延長(zhǎng)，兩成分的體內(nèi)協(xié)同作用較正常狀態(tài)下加強(qiáng)。

失眠模型大鼠給藥女貞子紅景天苷制備物給藥后，體內(nèi)主要以紅景天苷、酪醇兩種成分入血，其藥代動(dòng)力學(xué)特性表征為體內(nèi)酪醇、紅景天苷兩成分藥動(dòng)學(xué)協(xié)同吸收，且在失眠模型下，紅景天苷制備物兩入血成分生物利用度均較正常狀態(tài)下高，尤以酪醇與紅景天苷血藥濃度比值明顯增大，體內(nèi)兩成分酪醇與紅景天苷共血藥時(shí)間延長(zhǎng)；可見(jiàn)，在失眠模型下紅景天苷制備物藥物體內(nèi)成分藥動(dòng)學(xué)協(xié)同作用增強(qiáng)，表現(xiàn)出藥物對(duì)失眠病癥的親和性。

基于自然藥學(xué)觀指導(dǎo)思想，自然藥物具有自然性、協(xié)同性、親和性三大特性，本研究以藥物“三性”為研究導(dǎo)向，著力藥物組成成分研究、成分相互作用研究、成分與病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)研究，揭示了女貞子紅景天苷制備物藥物作為治療失眠病癥藥物的藥代動(dòng)力學(xué)表征特性，其在失眠模型下顯示出紅景天苷與酪醇構(gòu)成藥物體系，表征出藥代協(xié)同性與對(duì)失眠病癥狀態(tài)的親和性，為進(jìn)一步基于本制備物進(jìn)行抗失眠的藥物創(chuàng)新提供了科學(xué)依據(jù)。

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(本文編輯：董歷華)

·啟事·

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·論著·

作者單位：100069 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[韓虹娟(碩士研究生)、李冬華、張武芳、耿建國(guó)]；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦幼保健院(錢(qián)睿亞)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院婦科(許昕、黃玉華、趙文景)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院月壇社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科(倪婧)

Study on the pharmacokinetic characterization of salidroside drugs in the insomnia model rats

PENGPing，SUNDao-han，F(xiàn)ENGDuo，etal.KeyUnitofExploringEffectiveSubstancesofClassicalandFamousFormulasofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

【Abstract】ObjectiveTo study the pharmacokinetic characterization of Salidroside drug which was prepared from Fructus Ligustri Lucidi as a drug for insomnia treatment. MethodsThe drug content was measured by UPLC with PDA detector. Analyzes was performed on an ACQUITY UPLC H-CLASS T3(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column with salicin as the internal standard. The mobile phase was acetonitrile:water solution (3:97, v/v) at a flow rate of 0.3 mL/min. The temperature of column was 25℃. ResultsThe Cmax, Tmax, T1/2, and K of salidroside were 20.24 μg/mL, 0.5 h, 2.53 h, and 0.27 in insomnia rats, respectively; and the Cmax, Tmax of tyrosol were 0.49 μg/mL and 0.75 h respectively in insomnia rats. The maximum content ratio of tyrosol / salidroside was 3.90/100, which was 12.58 times higher than that in vitro. ConclusionSalidroside and tyrosol were the main components of salidroside drug into the blood and they exhibited a synergistic effect for absorption in the insomnia model rats. The bioavailability of drug was increased in insomnia model rats when compared with the health rats.

【Key words】Salidroside； Tyrosol； Pharmacokinetic； Insomnia； Adaptation

通訊作者：李冬華(1972- )，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥防治婦科腫瘤機(jī)制研究。E-mail:dududoctor@163.com

作者簡(jiǎn)介：韓虹娟(1987- )，女，2012級(jí)碩士研究生。研究方向：中藥防治婦科腫瘤機(jī)制研究。E-mail:hanhongjuan0508@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81373812，81073096)

(收稿日期：2014-09-10)

Corresponding author：SHI Ren-bing，E-mail:shirb@126.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.006