董笑克 魏競競 楊凱 吳迪 李彤 趙丕文 牛建昭

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡幼年Wistar清潔雌性大鼠60只，體質(zhì)量(50±5)g，均在21日齡斷乳［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001］。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 助仙丹配方顆粒:茯苓15 g、陳皮 15 g、白術(shù) 9 g、白芍 9 g、山藥 9 g、菟絲子 6 g、杜仲3 g、甘草3 g(購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房);炔雌醇環(huán)丙孕酮片(商品名:達(dá)英－35，拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司);注射用人絨毛膜促性腺激素(上海第一生化藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):1303031);左炔孕酮硅膠棒(上海達(dá)華藥業(yè)有限公司，規(guī)格:75 mg，生產(chǎn)批號(hào):20121128);血清睪酮酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(普博欣試劑公司)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 電子讀數(shù)分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，高速離心機(jī)(博勵(lì)行儀器有限公司)，普通手術(shù)器械，顯微鏡(Olympus)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立 60只大鼠于室溫18～22℃環(huán)境下適應(yīng)2天，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組，空白對(duì)照組8只，造模組52只?？瞻讓?duì)照組大鼠喂以普通飼料，正常飼養(yǎng)，于27日齡始每天頸背部皮下注射與實(shí)驗(yàn)組等量生理鹽水，共9天。造模組52只大鼠按照朱亮等［2］的方法，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后于24日齡開始，用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后皮下埋植左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒，3 mm/只，27日齡開始皮下注射人絨毛膜促性腺激素1.5 U，2次/天，共9天，35日齡連續(xù)陰道涂片2個(gè)動(dòng)情周期［(4～5)天×2］。觀察到陰道涂片染色(陰道涂片染色后觀察顯示無規(guī)律動(dòng)情周期，見大量白細(xì)胞，偶見少量角化細(xì)胞，處于動(dòng)情間期時(shí)相，提示無排卵，見圖1-A)。陰道涂片提示無排卵則符合PCOS大鼠模型，不符合者剔除。對(duì)照組連續(xù)陰道涂片2個(gè)動(dòng)情周期全部呈現(xiàn)完整的動(dòng)情周期，見圖1-B。

圖1 大鼠陰道涂片(次甲基藍(lán)染色，放大倍數(shù)40×10)

1.2.2 分組及給藥方法 對(duì)照組8只，從造模組中挑選出造模成功大鼠共30只，隨機(jī)分為模型組10只、助仙丹組10只、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組10只。助仙丹組與炔雌醇環(huán)丙孕酮片組于35日齡開始，于每天18:00藥物灌胃，助仙丹組給予助仙丹配方顆粒水溶液(將助仙丹顆粒2袋溶解于50 mL水中配得含生藥1.38 g/mL藥液)，每只大鼠予生藥8 g/kg助仙丹藥液灌胃;炔雌醇環(huán)丙孕酮片組大鼠給予炔雌醇環(huán)丙孕酮片(12 g/片，加水50 mL溶解配置0.24 g/mL藥液)，每只大鼠予藥液1.4 g/kg，連續(xù)給藥14天。模型組10只以及空白對(duì)照組8只，每天以0.58 mL/kg蒸餾水灌胃，1次/天，連續(xù)14天。所有大鼠試驗(yàn)期間均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)合籠飼養(yǎng)，室溫18～22℃，相對(duì)濕度50%，顆粒飼料自由擇食，保持每天光照14小時(shí)。

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量的變化

1.2.3 標(biāo)本的收集與處理 將49日齡大鼠禁12小時(shí)后稱重后，予1%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g腹腔麻醉，打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血(2～3 mL)，3000 rmp離心，分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法檢測血清性激素的水平，由普博欣試劑公司完成檢測。摘取雙側(cè)卵巢，去除卵巢表面脂肪組織，稱取卵巢質(zhì)量(濕重)，用10%的多聚甲醛液固定，用不同濃度的乙醇浸泡脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察卵巢的組織形態(tài)改變、卵泡的大小發(fā)育情況等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

4組大鼠治療前后均發(fā)育良好，體毛潤澤，行為、體征變化無明顯差異，反應(yīng)靈活。4組大鼠治療前后質(zhì)量變化值采用單因素方差分析，均服從正態(tài)分布;數(shù)據(jù)具有方差齊性;用 ANOVA分析，F(xiàn)=4.753，P=0.007 ＜0.05，可以認(rèn)為四組治療前后質(zhì)量變化值有顯著差異。采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明:與模型組比較，炔雌醇環(huán)丙孕酮片組大鼠用藥前后體質(zhì)量增加顯著減少(P＜0.05)。結(jié)論:助仙丹顆粒配方組、炔雌醇環(huán)丙孕酮片組大鼠用藥前后體質(zhì)量的增加均小于模型組，其中炔雌醇環(huán)丙孕酮片組大鼠體質(zhì)量增長更少，說明炔雌醇環(huán)丙孕酮片對(duì)于多囊卵巢模型大鼠體質(zhì)量具有明顯降低作用，兩組相比，助仙丹組大鼠體質(zhì)量變化與空白對(duì)照組大鼠相比無差異(P＞0.05)。

2.2 卵巢質(zhì)量及血清雄激素水平

大鼠卵巢質(zhì)量及血清雄激素水平變化均采用單因素方差分析，各組之間兩兩比較采用LSD法。與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠卵巢質(zhì)量明顯增加(P＜0.05);與模型組比較，炔雌醇環(huán)丙孕酮片組大鼠卵巢質(zhì)量降低明顯(P＜0.05)，模型組大鼠卵巢濕重明顯高于正常組大鼠卵巢濕重，而炔雌醇環(huán)丙孕酮片組、助仙丹組大鼠卵巢濕重均不同程度的下降。大鼠血清雄激素水平經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=0.726，P=0.544 ＞0.05，認(rèn)為四組大鼠血清雄激素水平?jīng)]有明顯差異，具體見表2。

表2 各組大鼠雙側(cè)卵巢濕重及血清雄激素比較

2.3 卵巢光鏡結(jié)果

空白組可見處于不同分化等級(jí)的卵泡，顆粒細(xì)胞層較厚，排列整齊，卵巢組織可見正常成熟卵泡、黃體以及白體;模型組大鼠卵巢內(nèi)罕見成熟卵泡，卵巢內(nèi)有數(shù)量較多的閉鎖卵泡，卵泡內(nèi)顆粒層薄(2～3層)，卵巢組織內(nèi)少見黃體及白體;炔雌醇環(huán)丙孕酮片組卵巢切片可見成熟卵泡及處于不同階段的卵泡，閉鎖卵泡較模型組明顯減少，顆粒層細(xì)胞數(shù)較模型組稍有增厚，但明顯少于正常組;助仙丹顆粒配方組大鼠卵巢中可見成熟卵泡及一定數(shù)目閉鎖卵泡，顆粒細(xì)胞層較模型組及炔雌醇環(huán)丙孕酮片組均明顯增加，接近空白對(duì)照大鼠顆粒層數(shù)目，但排列欠整齊，卵巢內(nèi)可見正常一定數(shù)目的黃體及白體。

圖2 各組大鼠卵巢切片(HE染色，放大倍數(shù):4×10)

3 討論

PCOS是婦科內(nèi)分泌臨床常見病，在排卵功能障礙不孕患者中占90%［3］，育齡婦女患PCOS的概率為5% ～10%，約占婦科內(nèi)分泌臨床病例數(shù)的20% ～60%，在閉經(jīng)婦女中占25%［4］。PCOS的臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，其病理生理也較為復(fù)雜，除對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生不利影響外，還易出現(xiàn)不孕癥、高胰島素血癥及心血管疾病等并發(fā)癥［5］。而且流行病學(xué)資料顯示隨著兒童期和青春期肥胖發(fā)生率的增高，青春期PCOS的發(fā)病率也有所增高，因此對(duì)于多囊卵巢綜合征的病因病機(jī)以及治療等的相關(guān)研究具有較為重要的臨床意義。但目前又無治療多囊卵巢綜合征的特效藥，近年來隨著中醫(yī)藥對(duì)其研究的深入，中醫(yī)藥治療PCOS已顯示其優(yōu)勢。助仙丹選自著名的女科專著《傅青主女科》，原方被用來治療“經(jīng)水?dāng)?shù)月一行”，傅青主評(píng)價(jià)此方“健脾益腎而不滯，解郁清痰而不滯”。而中醫(yī)對(duì)于PCOS的中醫(yī)病機(jī)認(rèn)識(shí)多為脾腎兩虛、痰濕阻滯、肝郁血瘀等。助仙丹中菟絲子、杜仲可溫補(bǔ)腎氣，腎氣足自可化濁，茯苓、山藥、白術(shù)等補(bǔ)脾氣，脾氣足則不生痰，痰濁即去，白芍可解肝郁、舒肝氣，方義與現(xiàn)代醫(yī)家對(duì)多囊卵巢綜合征的認(rèn)識(shí)較為一致，所用藥物均為婦科常用藥物，平補(bǔ)而不滯。

高雄激素血癥、卵巢多囊性改變、稀發(fā)排卵是PCOS較為特征性的改變，本研究就血清雄激素、卵巢形態(tài)等多方面研究分析助仙丹對(duì)多囊卵巢綜合征的作用效果及機(jī)理初探。結(jié)果表明，助仙丹可促進(jìn)多囊卵巢綜合征大鼠排卵并增加卵泡顆粒細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目、黃體組織數(shù)目，減少囊狀卵泡數(shù)目;與炔雌醇環(huán)丙孕酮片相比，助仙丹藥效較為溫和，對(duì)于增加顆粒細(xì)胞數(shù)有明顯優(yōu)勢，但在改善體重、卵巢濕重方面效果不如炔雌醇環(huán)丙孕酮片明顯。本研究表明助仙丹對(duì)PCOS大鼠卵巢形態(tài)、體質(zhì)量、卵巢濕重等具有改善作用，尤其對(duì)顆粒細(xì)胞層數(shù)增加有明顯作用，顆粒細(xì)胞可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，從而降低血清雄激素的含量，糾正多囊卵巢綜合征的高雄激素血癥，進(jìn)而促進(jìn)排卵、改善癥狀。本研究提示助仙丹加減對(duì)PCOS有一定的治療作用，但其確切的機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。

另外本實(shí)驗(yàn)仍有一些方面有待改善:(1)大鼠PCOS模型不夠持久，且造模成功率低，其造模結(jié)果與人類PCOS仍有不同;(2)助仙丹藥味少，各藥劑量小，作用也較炔雌醇環(huán)丙孕酮片弱，考慮按照不同證型的PCOS，調(diào)整助仙丹劑量，并可設(shè)立高、中、低劑量組，尋找助仙丹治療多囊卵巢綜合征的最佳有效劑量;(3)炔雌醇環(huán)丙孕酮片與助仙丹比較，炔雌醇環(huán)丙孕酮片在促進(jìn)排卵方面占優(yōu)勢，助仙丹在促進(jìn)卵巢形態(tài)恢復(fù)、增加顆粒層細(xì)胞的數(shù)目方面有明顯的優(yōu)勢，中西藥聯(lián)用是否有更好地療效仍待進(jìn)一步研究;(4)因?qū)嶒?yàn)經(jīng)費(fèi)及周期的限制，實(shí)驗(yàn)所用血清學(xué)指標(biāo)較少，可進(jìn)一步研究更多的性激素改變的結(jié)果，以求為助仙丹臨床應(yīng)用取得更多證據(jù)。

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