藺昕燕，賈玉紅，郭連英，賈玉杰，徐婷婷

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧大連116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧大連116044)

血管衰老是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一［1］。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)作為構(gòu)成血管壁最豐富的細(xì)胞群，位于大動(dòng)脈內(nèi)彈力膜下的血管中層，通過(guò)收縮功能調(diào)節(jié)血管管腔直徑、機(jī)體血壓以及全身的血流分布。VSMC 衰老與血管衰老及其相關(guān)血管疾病密切相關(guān)，衰老VSMC 相關(guān)的表型變化促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管壁膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)沉積，血管壁動(dòng)脈硬度隨年齡增長(zhǎng)極度增加從而導(dǎo)致動(dòng)脈功能下降，這種衰老相關(guān)的血管重構(gòu)使動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病易于發(fā)生［2］。

在正常人類(lèi)細(xì)胞，p53 或者p21 基因失活可以延長(zhǎng)細(xì)胞的復(fù)制性壽命，提示這條通路與細(xì)胞衰老有密切聯(lián)系［3］。p53 介導(dǎo)了細(xì)胞對(duì)DNA 損傷反應(yīng)，p53 既能介導(dǎo)由端粒縮短導(dǎo)致的復(fù)制性衰老，也能介導(dǎo)應(yīng)激導(dǎo)致的早老，它的下游靶分子是p21。p21是cyclin 依賴(lài)的蛋白激酶的抑制劑，能抑制細(xì)胞周期，使細(xì)胞進(jìn)入不可逆性生長(zhǎng)停滯。p21 是廣譜的細(xì)胞周期抑制劑，通過(guò)特異性抑制cyclinD1 -CDK4/CDK6、cyclinE -CDK2、cyclinA -CDK2 的蛋白激酶活性，既可導(dǎo)致G1期停滯也可以導(dǎo)致G2期停滯［4］。

本研究用Ang II 誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老，觀察衰老相關(guān)分子在VSMC 衰老中的變化，進(jìn)一步通過(guò)敲除p53 及過(guò)表達(dá)p21 來(lái)研究p53 -p21 通路在VSMC 衰老中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

SMCM 血管平滑肌細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基為Sciencell公司產(chǎn)品;DMEM 培養(yǎng)基為Gibco 公司產(chǎn)品;I 型膠原酶及彈性蛋白酶為Sigma 公司產(chǎn)品;Ang II 為Sigma 公司產(chǎn)品，貨號(hào)為A9525。SA -β -Gal 檢測(cè)試劑盒為Biovision 公司產(chǎn)品?？贵wAnti -p53(santa cruz 公司)，Anti -p21(Millipore 公司)，Anti -GAPDH、Anti-p16 (Abcam 公司)。p53+/+及p53-/-鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為C57BL/6 背景。實(shí)驗(yàn)所用腺病毒為根據(jù)大鼠p21 基因自行包裝，取擴(kuò)增第3 代以后使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng):VSMC 從SD 大鼠(雄性，8 周齡，180 ～200 g 左右)以及C57B/L 小鼠p53+/+及p53-/-(雄性，8 周齡，23 g 左右)胸主動(dòng)脈分離得到。于無(wú)菌狀態(tài)下速取胸主動(dòng)脈，分離其脂肪層，置于消化液collagenase mixture(含I 型膠原酶1.5 mg/mL、彈性蛋白酶100 μg/mL、BSA 2 mg/mL)，在37 ℃孵箱中消化40 min 左右，取出，剝離外膜(完全去除外膜)，直剪縱向剪開(kāi)血管，用棉棒破壞其內(nèi)膜，取平滑肌層，剪碎，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，大鼠VSMC 采用含20%血清的DMEM 培養(yǎng)液，貼塊法(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)，3 代以后換為10%血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)用第5 代細(xì)胞。小鼠VSMC 采用含2%血清及1%平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加物的Sciencecell培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，靜置5 d 后，再觀察可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)貼壁，周?chē)莱鲚^多的VSMC。實(shí)驗(yàn)用第7代細(xì)胞。所有細(xì)胞需經(jīng)形態(tài)學(xué)α-actin 免疫組化染色為陽(yáng)性證明為VSMC。

1.2.2 衰老相關(guān)β 半乳糖苷酶染色:按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，呈藍(lán)色染色細(xì)胞為衰老細(xì)胞。

1.2.3 VSMC 的腺病毒感染:把最少量的培養(yǎng)液(以能覆蓋細(xì)胞的體積為準(zhǔn))放入EP 管，加入終濃度為7 μg/μL 的多聚賴(lài)氨酸，混勻，室溫放置5 min再加入適量病毒(p21 和GFP，分成低、中、高3 個(gè)劑量梯度)，混勻，室溫放置100 min。將細(xì)胞用滅菌的PBS 洗2 遍后，加入上述病毒混和液，將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，感染細(xì)胞120 min 后，加入新鮮的完全培養(yǎng)液至常量，感染24 h 后熒光顯微鏡觀察95%以上細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光，則為成功感染。

1.2.4 Ang II 誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞衰老:在VSMC中加入含10-7mol/L Ang II 的含1%血清的維持培養(yǎng)基，持續(xù)作用5 d，培養(yǎng)基每天更換，對(duì)照組用相同體積的滅菌去離子水替代Ang II，5 d 后經(jīng)SA-βgal 染色證明半數(shù)以上細(xì)胞發(fā)生衰老，即衰老誘導(dǎo)成功。

1.2.5 Western-blot 檢測(cè):細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗2次，棄去PBS，加約為細(xì)胞5 倍體積的RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞，冰浴30 min。于4 ℃12000 r/min離心15 min。上清液即為細(xì)胞總蛋白。40 μg 蛋白經(jīng)10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，與p53、p21、p16、GAPDH 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，與相應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞周期同步化:接種1 ×105/孔細(xì)胞至6孔板，細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至60%融合時(shí)，分別感染ad GFP與ad p21 24 h 后，血清饑餓24 h 使細(xì)胞同步化，即換成無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液，24 h 后換為10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀測(cè)定(FCM)及Western-blot 檢測(cè)。

1.2.7 流式細(xì)胞檢測(cè):用2 mmol/L EDTA 胰酶消化細(xì)胞后，PBS 洗2 次，取2 ×104個(gè)細(xì)胞-20 ℃預(yù)冷的70%酒精固定4 h 以上，染色前用PBS 洗2 次，在0. 2% TritonX - 100、0. 2% EDTA，0. 04 mg/mL RNase 中37 ℃處理30 min，然后加20 μg/mL 碘化丙啶(PI)染色，F(xiàn)CM 檢測(cè)。

1.2.8 胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)(3H-TdR):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠VSMC，接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別感染ad GFP 與ad p21，感染12 h 后，換無(wú)血清的DMEM，同步化細(xì)胞24 h，向培養(yǎng)孔中加入含10%FBS 的培養(yǎng)液，孵育24 h，每組細(xì)胞取3 個(gè)孔，向每孔中加1 μCi 3H -TdR，棄上清液，用PBS 洗2 次后，加預(yù)冷的10%三氯乙酸(TCA)洗3 次，每次5 min。然后每孔加0.3 mL 0.3 mol/L NaOH，37 ℃處理30 min 或4 ℃裂解過(guò)夜，收集裂解液加于5 mL離心管中，加3 mL 閃爍液后，用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Ang II 刺激后VSMC 內(nèi)血管衰老相關(guān)基因表達(dá)的變化

VSMC 經(jīng)Ang II(10-7mol/L)作用第0、2、3、5天后，p53、p21、p16 的蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增加，尤其以p53 及p21 增加幅度更為明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 p53 基因敲除對(duì)Ang II 導(dǎo)致的小鼠VSMC 衰老的影響

Ang II 誘導(dǎo)后，經(jīng)SA -β -gal 衰老染色顯示，p53+/+VSMC 衰老細(xì)胞數(shù)明顯增加，而p53-/-VSMC明顯少于p53+/+VSMC(P ＜0.01)，見(jiàn)圖2。

圖1 Ang II 處理0、2、3、5 天后VSMC 蛋白表達(dá)的變化Fig 1 The expression of p53，p21，p16，GAPDH of VSMCs under Ang II administration

圖2 p53 敲除鼠及其同窩野生鼠VSMC 經(jīng)Ang II 處理后SA-β-gal 染色結(jié)果(SA-β-gal×100)Fig 2 Loss of p53 inhibit VSMC senescence induced by Ang II(SA-β-gal×100)

2.3 過(guò)表達(dá)p21 對(duì)VSMC 細(xì)胞周期停滯和衰老的影響

過(guò)表達(dá)p21 的VSMC 經(jīng)過(guò)24 h 饑餓時(shí)細(xì)胞周期同步化，血清刺激后，3H -TdR 摻入量在感染腺病毒GFP 組顯著增加，而感染腺病毒p21 組3H -TdR 摻入量明顯低于ad GFP 組(P ＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 p21 過(guò)表達(dá)抑制3H-TdR 摻入Fig 3 Over-expression of p21 suppress VSMC proliferation induced by 10% FBS

在血清刺激0 h，80%以上的細(xì)胞處于G1期，在血清刺激24 h 處于G1期VSMC 的比例明顯下降，與感染GFP 組比較，p21 過(guò)表達(dá)組明顯抑制細(xì)胞周期從G1向S 期轉(zhuǎn)化，使處于G1期的VSMC 的比例顯著升高，并呈現(xiàn)p21 劑量依賴(lài)性的升高，中度過(guò)表達(dá)p21(P ＜0.05)，高度過(guò)表達(dá)p21(P ＜0.01)。見(jiàn)圖4。

2.4 過(guò)表達(dá)p21 導(dǎo)致大鼠VSMC 衰老

在不加任何刺激情況下，培養(yǎng)到第5 天時(shí)，與GFP 組比較，p21 過(guò)表達(dá)的VSMC 發(fā)生顯著衰老。見(jiàn)圖5。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)用Ang II 誘導(dǎo)VSMC 衰老，Ang II 在調(diào)節(jié)心血管結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮作用，既作為體內(nèi)最強(qiáng)的血管收縮因子，也是細(xì)胞內(nèi)的促有絲分裂信號(hào)因子。Ang II 信號(hào)通路激活對(duì)血管老化的發(fā)生和發(fā)展起重要作用，有研究表明老齡時(shí)動(dòng)脈壁的Ang II表達(dá)增加［5］，并且與老齡大動(dòng)脈壁的重構(gòu)密切相關(guān)［6］。年輕大鼠長(zhǎng)期應(yīng)用Ang II 導(dǎo)致動(dòng)脈中膜增厚和內(nèi)膜VSMC 浸潤(rùn)，引起和老齡大鼠動(dòng)脈相似的動(dòng)脈壁血管重構(gòu)變化［7］。強(qiáng)烈Ang II 信號(hào)激活及長(zhǎng)時(shí)間的Ang II 處理能導(dǎo)致VSMC 的衰老。Ang II會(huì)引起兩種類(lèi)型的VSMC 衰老，分別是不伴端?？s短的應(yīng)激導(dǎo)致的早老和使端?？s短加速的復(fù)制性衰老［8］。衰老相關(guān)分子p53，p21，p16，KiRas2A 是Ang II 引起衰老的下游執(zhí)行者［9］。本研究也證明了Ang II 誘導(dǎo)VSMC 衰老后，衰老相關(guān)分子p53，p21，p16 呈時(shí)間依賴(lài)性增加，尤其以p53、p21 增加顯著，提示p53 -p21 通路在Ang II 導(dǎo)致VSMC 衰老起重要作用。為了進(jìn)一步研究p53 -p21 通路在Ang II導(dǎo)致VSMC 衰老中作用，本實(shí)驗(yàn)利用p53 敲除鼠及其同窩野生型鼠的VSMC，采用SA -β -gal 染色方法顯示衰老的VSMC，結(jié)果表明p53 基因敲除明顯降低VSMC 衰老。在p53 的下游基因中，有幾種是與細(xì)胞周期停滯引起細(xì)胞衰老有關(guān)，其中p21 是p53 執(zhí)行激活細(xì)胞衰老的下游靶基因已為人共識(shí)，除p21 之外，有研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞PAI -I 也是執(zhí)行衰老功能的p53 的下游靶基因［10］。BTG2 和GADD45a 是復(fù)制性衰老起作用的p53 的下游。這些p53 的下游執(zhí)行不同的功能防止細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和因基因組不穩(wěn)定性導(dǎo)致腫瘤形成［11］。為了進(jìn)一步探究p21 在VSMC 衰老中所起的作用，本研究在VSMC 中單獨(dú)過(guò)表達(dá)p21，不用Ang II 等導(dǎo)致衰老因素的刺激就能引起VSMC 衰老，說(shuō)明p21 是引起VSMC 衰老的重要執(zhí)行者。本研究也檢測(cè)了衰老相關(guān)分子p16 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p16 的增加不如p21明顯，并且在Ang II 作用晚期才出現(xiàn)明顯增加。文獻(xiàn)報(bào)道在血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯中作用較強(qiáng)的是p27 和p21，有研究表明在VSMC 內(nèi)過(guò)表達(dá)p21 或p27 導(dǎo)致完全的細(xì)胞周期阻滯，而過(guò)表達(dá)p16出現(xiàn)部分細(xì)胞的G1期阻滯。這是因?yàn)檫^(guò)表達(dá)p21或p27 失活CDK2 和CDK4 導(dǎo)致G1期阻滯，p16 只抑制CDK4，但是對(duì)CDK2 沒(méi)有明顯抑制作用，因此不能將VSMC 完全阻滯在G1期［12］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示p53 -p21 通路是參與VSMC 衰老的重要通路。也提示了如果藥物或者某些治療能抑制p53 -p21 通路尤其是抑制p21 表達(dá)可能延緩VSMC 衰老，因?yàn)閂SMC 衰老引起動(dòng)脈功能減退及引起衰老相關(guān)血管疾病，因此，抑制VSMC 的p21 表達(dá)可能對(duì)延緩動(dòng)脈衰老和預(yù)防及治療衰老相關(guān)血管疾病方面起作用。

圖4 過(guò)表達(dá)p21 引起VSMC 細(xì)胞周期G1 期阻滯Fig 4 Over-expression of p21 cause VSMC G1 phase block in a dose dependent manner

圖5 過(guò)表達(dá)p21 導(dǎo)致VSMC 衰老 (SA-β-gal×100)Fig 5 Over-expression of p21 induce VSMCs senescence (SA-β-gal×100)

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