牛偉濤
(邢臺學院化學工程與生物技術(shù)學院,河北邢臺 054001)
豬干擾素基因的克隆與原核表達載體的構(gòu)建
牛偉濤
(邢臺學院化學工程與生物技術(shù)學院,河北邢臺 054001)
干擾素(Interferon)是一種廣譜抗病毒劑,具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種作用而被廣泛應用于病毒性疾病的預防和治療。本實驗以豬肝臟組織為材料,提取豬肝臟組織DNA,根據(jù)GenBank收錄的豬干擾素基因序列設計特異性引物,以豬肝臟DNA為模板進行高保真擴增得到IFN基因的ORF片段,然后進行了T載體克隆。再利用引入EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點的特異性引物對IFN成熟肽段的基因進行亞克隆,經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化后,成功構(gòu)建了pET28a-ifn原核表達重組質(zhì)粒,為干擾素基因的原核表達奠定了基礎。
豬干擾素基因;基因克隆;表達載體構(gòu)建
干擾素是一種細胞因子,具備免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等作用,它是科學家在1957年研究流感病毒干擾現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)的[1]。干擾素是一類分泌型糖蛋白,它主要通過與細胞表面受體相互作用從而使細胞、組織或器官產(chǎn)生一種或幾種抗病毒的蛋白,這樣便可以增強免疫應答[2]。干擾素主要由激活的胸腺細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生,病毒入侵時,干擾素在短時間內(nèi)就能讓機體處于抗病毒形態(tài),并使機體在1~3周時間內(nèi)抵制病毒反復感染[3]。生物體中廣泛存在干擾素,人、豬、羊等哺乳動物都產(chǎn)生干擾素。我國豬場眾多,大小豬病毒性傳染病隨季節(jié)變化危害較大,種類繁多,給很多養(yǎng)殖戶造成巨大損失,干擾素就成為醫(yī)藥、獸藥市場最具發(fā)展前景的一類生物制劑[4]。如果利用基因工程的方法將豬干擾素基因進行原核表達,可以為豬干擾素的應用研究提供堅實的基礎。
1.1 實驗器材
TC-96/G/HLife Express基因擴增儀(杭州博日科技有限公司),BD-1000超微量核酸蛋白分析儀(北京五州東方科技發(fā)展有限公司),ZX-2020D凝膠成像分析系統(tǒng)等。
1.2 藥品試劑
2×pfu高保真Taq Mix(上海捷瑞生物工程公司);T4 DNA連接酶、DNA Marker(TaKaRa大連公司);PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程公司);卡納青霉素、氨芐青霉素(索萊寶生物科技有限公司)等藥品。
2.1 基因組DNA的提取
取20 mg豬肝臟組織,用冰冷生理鹽水洗3次,置于液氮中充分研磨,然后參考DNA提取試劑盒說明書方法進行操作,然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 干擾素基因的PCR擴增
2.2.1 引物設計
根據(jù)Genbank中的豬干擾素基因序列,利用PrimerPremier5.0設計所需特異性引物。豬干擾素基因ORF序列擴增上游引物為5’ATGGCCCCAACCTCAGCCTTC3’;下游引物為5’TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTC3’。豬干擾素基因成熟肽序列擴增上游引物為5’CGGAATTCTGCGACCTGCCTCAGAC3’,含EcoRⅠ酶切位點;下游引物為5’GCGTCGACTCACTCCTTCTTCCTGAGTC3’,含SalⅠ酶切位點。
2.2.2 PCR擴增
PCR反應體系為:2×PfuTaq Mix,25μl;上下游引物各2μl,模板為1μl,加dd H2O補齊至50μl;
PCR反應程序為:94℃ 5min;94℃ 30sec,52℃30sec,72℃45sec,30個循環(huán);72℃10min;4℃保存。
2.3 PCR產(chǎn)物的純化
PCR產(chǎn)物參照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書進行回收,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.4 連接與轉(zhuǎn)化
連接反應體系:DNA片段3μl;載體1μl;T4 DNA連接酶0.5μl;10×Buffer 0.5μl;dd H2O,1 μl。16℃連接過夜。用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞,將連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化。
2.5 酶切鑒定
反應體系:重組質(zhì)粒12μl;重組質(zhì)粒12μl;EcoRⅠ1μl;SalⅠ1μl;10×Buffer 2μl;dd H2O2μl。37℃,30min。
3.1 干擾素基因的PCR擴增
利用設計的特異性引物,以豬肝臟基因組DNA為模板,對豬干擾素基因的ORF進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并,如圖1所示,在約570bp的位置出現(xiàn)了特異性擴增帶。
圖1 干擾素基因ORF的PCR擴增M:DNA分子量標準;1:PCR產(chǎn)物
3.2 測序結(jié)果
將陽性T載克隆進行測序分析,結(jié)果顯示,成功克隆得到長為570bp的豬干擾素基因的ORF片段,序列如下:
ATGGCCCCATCCTCAACTCTCCTCACGGTCCT GGTGCTGCTCAGCTGCAATGCCATCTGCTGTCTGG GCTGCAACCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGCTCAT ACCAGGGCCCTGAGGCTCCTGGCACAAATGAGGA GAATCTCCCCCTTCTCCTGCCTGGACCACAGAAGG GACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCA ACCAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCATGGCTCTGGT GCATGAGATGCTCCAGCAGACCTTCCAGCTCTTCA GCACAGAGGGCTCGGCTGCTGCCTGGGATGAGAG CCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGC AGCTCAGGGACCTGGAAGCCTGTGTCATGCAGGA GGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAG GACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCACAG ACTCACCCTCTATCTGCAAGAGAAGAGCTACAGC CCCTGTGCCTGGGAGATCGTCAGGGCAGAAGTCA TGAGAGTCTTCTCTTCCTCCACAAACCTGCAAGAC AGACTCAGGAAGAAGGAGTGA
3.3 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴增
利用特異性引物成功擴增到了干擾素成熟肽段基因序列片段,如圖2所示。
圖2 干擾素成熟肽段基因序列的PCR擴增M:DNA分子量標準;1:PCR產(chǎn)物
3.4 重組質(zhì)粒的鑒定
利用 EcoRⅠ與 SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pET28a-inf重組質(zhì)粒進行雙酶切實驗,如圖3電泳檢測結(jié)果顯示pET28a-inf重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
圖3 pET28a-inf重組質(zhì)粒的鑒定M:DNA分子量標準;1:pET28a-inf質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物
實驗成功克隆得到豬干擾素基因ORF片段,序列長度為570bp。豬干擾素基因ORF中含有信號肽序列,實驗中利用特異性引物擴增得到成熟肽的編碼序列,擴增產(chǎn)物長度為490bp。限制性雙酶切鑒定表明豬干擾素基因已成功插入pET28a載體,成功構(gòu)建了pET28a-inf表達載體,這為下一步豬干擾素基因能在原核表達系統(tǒng)進行高效表達打下了堅實的基礎。
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圖4 CPU SFR Memory
圖5 Internel Memory
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Q78
A
1672-4658(2015)04-0175-03
2015-6-29
邢臺市科學計劃項目(2014ZC019);邢臺學院科學研究項目(2014)
牛偉濤(1982-),男,講師,博士在讀,主要從事分子生物學與基因工程研究.