沈佩婷，方 磊，吳惠梅，沈啟英，何 芳，劉榮玉

Toll樣受體2介導的JNK信號分子在小鼠支氣管哮喘發(fā)病中的作用機制

沈佩婷，方 磊，吳惠梅，沈啟英，何 芳，劉榮玉

摘要目的 探討Toll樣受體2（TLR2）介導的c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號分子參與小鼠支氣管哮喘發(fā)病的作用機制。方法 健康SPF級C57（TLR2野生型）鼠和TLR2基因缺失（TLR2-／-）鼠各14只，按隨機數(shù)字表法分為4組：C57對照組、C57哮喘組、TLR2-／-對照組、TLR2-／-哮喘組，每組7只，哮喘組以卵清蛋白（OVA）腹腔注射聯(lián)合霧化吸入致敏和激發(fā)建立哮喘模型，對照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。利用免疫組織化學染色技術(shù)（ABC法）檢測TLR2蛋白在C57對照組、C57哮喘組肺內(nèi)的表達差異，JNK及磷酸化JNK（P-JNK）蛋白表達在各組肺內(nèi)的表達差異。結(jié)果 HE染色提示較其余3組，C57哮喘組有較明顯的炎癥細胞浸潤及呼吸道平滑肌增生。以平均吸光度（mA）衡量各組織蛋白相對表達量，免疫組化結(jié)果提示TLR2蛋白在C57哮喘組表達顯著高于C57對照組（P＜0.01），JNK蛋白在各組的表達差異無統(tǒng)計學意義，P-JNK蛋白在C57哮喘組肺組織的表達量顯著高于C57對照組、TLR2-／-哮喘組、TLR2-／-對照組（F＝43.261，P＜0.01）。結(jié)論 TLR2介導的JNK信號分子通路可能參與了支氣管哮喘的發(fā)病過程。

關(guān)鍵詞哮喘；TLR2；JNK；P-JNK；免疫組化

2015-02-02接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部呼吸科，安徽省老年病研究所，合肥 230022

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是多基因參與的具有遺傳易感性的慢性呼吸道變應(yīng)性疾病，其發(fā)病涉及多種炎癥細胞、炎性介質(zhì)和復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)。Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs）是參與非特異性免疫（天然免疫）的一類重要蛋白質(zhì)分子，同時具有激活和調(diào)節(jié)特異性免疫系統(tǒng)的作用。TLR2在調(diào)控哮喘的發(fā)病機制中扮演的角色備受爭議［1-2］。TLRs的激活依賴于連接蛋白髓樣分化蛋白88的結(jié)合，將信號傳至胞內(nèi)Toll／IL-1受體同源結(jié)構(gòu)域，從而激活下游的信號轉(zhuǎn)導通路，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導激酶，促絲裂原活化蛋白激酶，通過c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）激活活化蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族，即可啟動細胞內(nèi)炎性因子的合成及釋放［3-4］。但TLR2激活JNK信號分子通路參與哮喘的發(fā)病過程少見報道?；谝陨涎芯勘尘?，該研究建立TLR2-／-小鼠哮喘模型，擬從形態(tài)學角度探討TLR2介導的JNK信號分子通路在哮喘發(fā)病中的可能機制。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 非特定病原體雌性小鼠，6～8周齡，SPF級C57小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）及TLR2-／-小鼠（中國科學技術(shù)大學生命科學院田志剛教授饋贈）各14只，（25±2）g。飼養(yǎng)于中國科學技術(shù)大學生命科學學院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實驗動物級環(huán)境設(shè)施標準。

1.1.2 實驗器材和試劑 超聲霧化器402AI（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、硫酸鋁鉀（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；兔抗鼠TLR2多克隆抗體（美國Abcam公司）；兔抗鼠JNK、P-JNK多克隆抗體（美國CST公司）；SP9000免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型復(fù)制 按照隨機數(shù)字表法將C57及TLR2-／-小鼠各14只分成4組：C57對照組、C57哮喘組、TLR2-／-對照組、TLR2-／-哮喘組。哮喘組小鼠于第0天腹腔注射10 μg OVA和含1 mg硫酸鋁鉀的生理鹽水溶液0.5 ml致敏。第14天開始激發(fā)，給予1%OVA生理鹽水50 ml霧化吸入，1次／d，30 min／次，連續(xù)7 d。對照組參照哮喘組方法，只是致敏和激發(fā)時均以生理鹽水代替OVA。各組均于末次激發(fā)后24 h處死，切下一半右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，用

于HE染色及免疫組化檢測。

1.2.2 HE染色檢測肺組織病理變化 光鏡（× 10）下觀察HE染色的支氣管肺組織周圍炎癥細胞浸潤、平滑肌增生情況。

1.2.3 免疫組織化學檢測蛋白表達 切片常規(guī)脫蠟至水，采用高火微波修復(fù)抗原，檸檬酸緩沖液pH ＝6.0。3%過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性及0.3%Triton-X 100增加肺組織通透性，以5%山羊血清（A液）封閉減少非特異性表達。滴加一抗，37℃孵育1 h后4℃過夜（視抗體表達程度可適當予以延長），PBS洗滌后，生物素標記的二抗（B液）處理30 min，辣根過氧化物酶標記的C液37℃孵育30 min，ABC液均為SP9000檢測試劑盒內(nèi)容物，DAB顯色，鏡下控制染色時間，含有粗細不一的棕黃色顆粒即為陽性細胞。蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。每張切片隨機選擇4個結(jié)構(gòu)較完整的支氣管（×20），應(yīng)用JD 801D圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度（mean absorbance，mA），代表各蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0軟件分析，計量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本均數(shù)采用單因素方差分析法，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。

2　結(jié)果

2.1 小鼠行為學改變 哮喘組在激發(fā)時均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸急促、毛發(fā)豎直、大小便失禁等癥狀，嚴重者呼吸減慢，行動遲緩，而對照組無明顯上述表現(xiàn)。

2.2 肺組織形態(tài)學改變 光鏡示C57哮喘組支氣管、血管周圍大量炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞增多，呼吸道上皮黏液腺增生，支氣管壁明顯增厚、管腔狹窄，肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂，而C57對照組及TLR2-／-對照組支氣管周圍則有少量炎癥細胞浸潤，無明顯平滑肌增生、支氣管壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)完整。TLR2-／-哮喘組炎癥細胞浸潤及平滑肌增生等較C57哮喘組有所減弱。見圖1。

2.3 肺組織TLR2、JNK、P-JNK蛋白表達TLR2、JNK、P-JNK蛋白主要表達定位在胞質(zhì)和胞核，支氣管上皮細胞、平滑肌細胞及浸潤的炎癥細胞均可見表達。TLR2蛋白在C57哮喘組肺組織的表達量顯著高于C57對照組（P＜0.01），見圖2、表1。JNK蛋白在各組中的表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖3、

表1。P-JNK蛋白在C57哮喘組肺組織的表達量顯著高于C57對照組、TLR2-／-哮喘組、TLR2-／-對照組（F＝43.261，P＜0.01），見圖3、表1。

表1　TLR2、JNK、P-JNK在各組小鼠肺組織mA比較（n＝7，±s）

表1　TLR2、JNK、P-JNK在各組小鼠肺組織mA比較（n＝7，±s）

與C57對照組比較：**P＜0.01；與其他3組比較：＃＃P＜0.01

組別　TLR2蛋白含量　JNK蛋白含量　P-JNK 蛋白含量C57對照0.199±0.014　0.385±0.018　0.286±0.024 C57哮喘　0.448±0.096**0.358±0.050　0.534±0.099＃＃TLR2-／-對照　　-　0.344±0.076　0.205±0.040 TLR2-／-哮喘　-　0.383±0.076　0.322±0.037

3　討論

TLRs在參與哮喘氣道炎癥的不同細胞上均有表達，如上皮細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞［5］和氣道平滑?。?］。Ferreira et al［1］收集24例致命性哮喘患者的臨床標本，發(fā)現(xiàn)TLR2蛋白在氣道上皮的表達較對照組升高。Th2細胞及其分泌的細胞因子的增多在哮喘的發(fā)病中起著重要的作用，Re-

decke et al［7］發(fā)現(xiàn)TLR2的配體Pam3Cys通過持續(xù)性誘導Th2反應(yīng)，下調(diào)Th1因子，從而使免疫反應(yīng)向Th2優(yōu)勢的方向發(fā)展，促進實驗性哮喘的發(fā)生，而另一項研究［2］顯示TLR2的配體Pam3Cys通過降低氣道高反應(yīng)性，減弱肺內(nèi)Th2型炎癥反應(yīng)及特異性IgE的分泌等抑制哮喘的發(fā)生。

有研究［8-9］顯示，TLR2基因變異是哮喘易感性的主要決定因素。研究［10］表明，TLR2-／-時哮喘組小鼠氣道炎癥浸潤程度顯著降低，且一種新型的晚期炎癥介質(zhì)即高遷移率族蛋白1信號分子在BALF及肺組織中的表達亦減少。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過OVA致敏及激發(fā)小鼠成功建立哮喘模型，進一步提出TLR2介導了JNK信號通路參與哮喘的發(fā)病機制。免疫組織化學直觀地顯示出TLR2蛋白在C57哮喘組的表達顯著高于C57對照組，與上述TLR2可能促進小鼠支氣管哮喘發(fā)生的結(jié)論相符。

JNK是促絲裂原活化蛋白激酶超家族成員之一，通過三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，完成JNK磷酸化，從而在炎癥反應(yīng)的諸多方面發(fā)揮免疫調(diào)控作用［11］。Nath et al［12］通過哮喘造模發(fā)現(xiàn)JNK信號通路在氣道炎癥、氣道重塑及伴隨的氣道高反應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。Oltmanns et al［13］研究證實在氣道慢性炎癥和重構(gòu)過程中，JNK是一個重要的信號分子，可促進氣道平滑肌細胞分泌炎性因子如活性調(diào)節(jié)蛋白、白介素-8等。有研究［14］表明P-JNK與哮喘氣道重塑密切相關(guān)，表現(xiàn)為蛋白表達量升高，而JNK作為P-JNK的前體其表達量無顯著差異。本研究免疫組織化學檢測JNK蛋白在各組之間的表達無明顯差異，P-JNK在哮喘組中表達升高與以上結(jié)論相符。

肺泡巨噬細胞主要通過吞噬病原體和協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)來調(diào)控天然免疫應(yīng)答，參與哮喘的發(fā)病，F(xiàn)ang et al［15］通過金黃色葡萄球菌刺激RAW264.7肺泡巨噬細胞系，發(fā)現(xiàn)TLR2基因沉默可以顯著地降低PJNK在巨噬細胞的表達，推測TLR2可能活化并介導了JNK信號通路。Watanabe et al［16］也有過類似的發(fā)現(xiàn)。本研究中免疫組織化學檢測顯示活化的P-JNK在C57哮喘組顯著升高，TLR2-／-時其表達量則明顯降低。因此，推測TLR2蛋白在誘發(fā)哮喘過程中占主導地位，同時進一步激活并介導JNK信號分子參與小鼠支氣管哮喘的發(fā)生，但其確切的調(diào)控機制仍需深入探討。

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Mechanism of c-Jun N-terminal kinase mediated by Toll like receptor 2 in murine asthma

Shen Peiting，F(xiàn)ang Lei，Wu Huimei，et al
（Dept of Geriatric Pulmonary，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Geriatric Institute of Anhui Province，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the mechanism of c-Jun N-terminal kinase mediated by Toll like receptor 2 in murine asthma.Methods 14 healthy SPF grade C57 wild-type mice and 14 TLR2 knockout（TLR2-／-）mice were randomly divided into four groups：C57 control group，C57 asthma group，TLR2-／-control group，TLR2-／-asthma group（n＝7）.We utilized intraperitoneal injection combined with inhalation of ovalbumin（OVA）to sensitize and challenge the mice，thus establishing the experimental models of asthma.Meanwhile，the control group received normal saline instead of OVA.The protein expression of TLR2 was detected by immunohistochemistry（ABC method）in C57 control group and C57 asthma group，as well as JNK and phosphorylation c-Jun（P-JNK）between each group.Results In C57 asthma group，HE-staining showed more obvious inflammatory cell infiltration around bronchi and airway smooth muscle hyperplasia than the other three groups.The relative protein expressions were measured by mean absorbance（mA）.Immunohistochemistry indicated that mean absorbance values of TLR2 was significantly higher in C57 asthma group than those of C57 control group（P＜0.01）.There was no obvious difference of JNK protein expression between each group.The immunoexpression of P-JNK in C57 asthma group was notablely higher than those of C57 control group，TLR2-／-asthma group，TLR2-／-control group（F＝43.261，P＜0.01）.Conclusion TLR2-mediated JNK signaling molecules may be involved in the process of murine asthma.

Key wordsasthma；Toll like receptor 2；c-Jun N-terminal kinase；phosphorylation c-Jun N-terminal kinase；immunohistochemistry

作者簡介：沈佩婷，女，碩士研究生；劉榮玉，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：rongyuliu＠gmail.com

基金項目：國家自然科學基金（編號：81270082、81170030、81300027）；高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20113420110006）；安徽省重點實驗室計劃項目（編號：1206c0805028）；安徽省科技攻關(guān)項目（編號：12010402135）

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0573-04

中圖分類號R 562.2＋5；Q 241；Q 74