張紅麗，馮定慶，凌 斌，3，尤青葉，李 兵，伍嬌嬌，趙婷婷

沉默Piwil2表達(dá)對子宮頸癌細(xì)胞增殖和衰老的影響

張紅麗1，馮定慶2，凌 斌1，3，尤青葉1，李 兵1，伍嬌嬌1，趙婷婷1

摘要目的 采用shRNA沉默Piwil2基因的表達(dá)，探討其對宮頸癌細(xì)胞株增殖和衰老特性的影響。方法 通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染技術(shù)和嘌呤霉素篩選，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)Sh-piwil2宮頸癌細(xì)胞株，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot法驗證沉默效果。采用細(xì)胞增殖實驗、集落形成實驗、細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老等實驗觀察沉默Piwil2表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sh-piwil2宮頸癌細(xì)胞株，與對照組相比，沉默Piwil2表達(dá)后細(xì)胞的增殖和集落形成能力均顯著降低（P＜0.05）；細(xì)胞G0／G1期比例增加、S期比例明顯下降（P＜0.05），同時沉默Piwil2后細(xì)胞衰老數(shù)量明顯增多（P＜0.05）。結(jié)論 沉默Piwil2基因可發(fā)揮抗宮頸癌作用，推測Piwil2基因可作為宮頸癌臨床治療的一個潛在靶點。

關(guān)鍵詞宮頸癌；shRNA；Piwil2；細(xì)胞增殖；細(xì)胞衰老

2015-01-12接收

3衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100086

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)第一位惡性腫瘤，目前手術(shù)與化療是主要的治療手段，但并發(fā)癥、副作用等使治療具有局限性，迫切需要一種更為有效的方法來達(dá)到治愈宮頸癌的目的［1］。研究［2］證實腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源，因此尋找一種特異性表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞中的基因作為靶點會為宮頸癌的治療帶來突破。Piwil2蛋白是AGO／PIWI蛋白家族的一種，正常情況下只表達(dá)在睪丸組織中，另外也可特異性表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞中，賦予腫瘤干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化能力［3］。課題組前期研究［4］也證實Piwil2可作為宮頸癌干細(xì)胞的特異標(biāo)志物之一。該研究運用shRNA沉默宮頸癌細(xì)胞株中Piwil2基因的表達(dá)，觀察對細(xì)胞增殖和衰老等特性的影響，為探討Piwil2基因作為宮頸癌治療靶點提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人宮頸癌C33A和Hela細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)重點實驗室保存；實驗所需質(zhì)粒pGFP-VRS shRNA-piwil2由美國Origene公司構(gòu)建和合成；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國Axygen公司；RNA提取試劑TRIzol、DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Invitrogene公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的擴(kuò)增與提取 將購買的ShRNA-piwil2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)大腸桿菌，42℃熱擊、冰浴、搖床、涂板、37℃培養(yǎng)16 h，挑選卡那霉素陽性菌落，搖菌，菌種于-20℃保存。參照Takara Min-BEST質(zhì)粒小量提取試劑盒操作規(guī)程提取純化質(zhì)粒。

1.2.2 穩(wěn)定表達(dá)Sh-piwil2宮頸癌細(xì)胞系的建立將宮頸癌C33A和Hela細(xì)胞以2×105個／孔接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%時，采用Lipofectamine2000進(jìn)行Sh-piwil2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h

后更換完全培養(yǎng)基。嘌呤霉素持續(xù)壓力篩選出陽性細(xì)胞克隆，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)情況。

1.2.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測Piwil2 mRNA的表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，穩(wěn)定保存。采用qRT-PCR檢測Piwil2 mRNA的相對表達(dá)水平。Piwil2基因上、下游引物序列分別為5′-GTGCCAGAAACCGTTGAATC-3′、5′-TTGTGTTTCTGTGCGTCGTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為102 bp；內(nèi)參GAPDH基因的上、下游引物序列分別為5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，5′-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為99 bp。

1.2.4 Western blot法檢測Piwil2蛋白的表達(dá)水平

在館藏圖書流通實踐中，流通部門通常關(guān)注預(yù)約頻次超過2次的圖書類別。表1顯示，O類、P類和Q類圖書應(yīng)引起流通部門的注意。根據(jù)預(yù)約率與預(yù)約頻次兩個指標(biāo)，流通部門通常認(rèn)定預(yù)約率大于0.5%并且預(yù)約頻次大于2次即為需要提高復(fù)本數(shù)量的圖書類別。因此，本館的流通部門有必要通知采編部門在以后的圖書采購中注意增加O類和Q類圖書的復(fù)本數(shù)量。這也符合《黑龍江東方學(xué)院圖書館文獻(xiàn)采訪條例》第九條規(guī)定：重點搜集本院特色專業(yè)“生物工程”“食品科學(xué)與工程”和“高分子材料與工程”以及理工類基礎(chǔ)課“數(shù)學(xué)”“物理”和“化學(xué)”等教學(xué)和科研所需的各種類型文獻(xiàn)。

收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入SDS煮沸變性，取60 μg蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE膠110 V恒壓電泳1.5 h分離，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入兔抗人Piwil2抗體（稀釋度1∶800）和兔抗人GAPDH抗體（稀釋度1∶2 000），4℃孵育過夜，TBS-T洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h，TBS-T洗膜，暗室壓片顯影。

1.2.5 CellTiter96AQueous細(xì)胞增殖法檢測宮頸癌細(xì)胞增殖情況 將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×104個／孔接種于96孔板中，分別于24、48、72、96 h加入CellTiter96Aqueous單溶液40 μl，37℃避光孵育2 h，于酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測吸光度值（optical density，OD490）。

1.2.6 細(xì)胞集落形成實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按每孔500個細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d換1次液，3個星期后終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，拍照，顯微鏡下計算超過50個細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測宮頸癌細(xì)胞周期的變化細(xì)胞離心棄上清液后，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇溶液，-20℃固定過夜，次日離心棄乙醇，PBS水化15 min，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，室溫孵育30 min后上機(jī)檢測。

1.2.8 β-半乳糖苷酶染色法檢測細(xì)胞衰老 收集兩組細(xì)胞離心后重懸，以1×106個／孔接種于6孔板中，貼壁24 h后用細(xì)胞衰老試劑盒染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞衰老情況并計數(shù)其比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，模塊分析用t檢驗，數(shù)值均以±s表示，每組實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)C33A和Hela細(xì)胞對Piwil2表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞可見綠色熒光，見圖1；qRT-PCR和Western blot法顯示，沉默Piwil2組與對照組相比，其Piwil2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低（t＝9.526、1.628，P＜0.05），見圖2。以上實驗證明成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sh-piwil2宮頸癌細(xì)胞株。

2.2 沉默Piwil2表達(dá)抑制C33A和Hela細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞增殖實驗顯示，分別從72 h和48 h開始，沉默Piwil2組細(xì)胞增殖均較對照組緩慢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.943、5.167，P＜0.05），見圖3。集落形成實驗的結(jié)果表明，沉默Piwil2組的C33A 和Hela細(xì)胞的每孔集落形成數(shù)分別為（64.67± 5.86）個／孔、（88.87±6.62）個／孔，較對照組（327.67±16.56）個／孔、（399.01±16.09）個／孔有明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝25.93、29.44，P ＜0.05），見圖4。實驗表明與對照組相比，沉默Piwil2組細(xì)胞的增殖能力下降。

2.3 沉默Piwil2的表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，沉默Piwil2組C33A和Hela細(xì)胞的G0／G1期比例增加（t ＝10.90、11.36，P＜0.01），S期比例減少（t＝16.15、28.59，P＜0.01），G2／M變化不明顯，見表1。證明沉默Piwil2的表達(dá)可使細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。

表1　細(xì)胞周期實驗統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

2.4 沉默Piwil2基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞衰老 β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老情況，結(jié)果顯示沉默Piwil2組表達(dá)的C33A和Hela細(xì)胞其細(xì)胞衰老程度［（49.02±2.01）%、（41.33±5.87）%］均較對照組［（24.67±3.51）%、（14.67±2.52）%］增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10.43、7.428，P＜0.05），表明沉默Piwil2基因表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞衰老數(shù)增加，見圖5。

3　討論

Piwil2基因位于人的第8號染色體和鼠的第14號染色體上，可表達(dá)于不同種屬睪丸組織的生殖干細(xì)胞中，而在其他正常組織中很少表達(dá)。Piwil2蛋白分子量為110 ku左右，屬于一種進(jìn)化高度保守的堿性蛋白，包括PAZ和PIWI兩種結(jié)構(gòu)域，可與長度為25～31nt的Piwi相關(guān)RNA相互作用結(jié)合，通過DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳修飾機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子基因沉默，保護(hù)生殖干細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和完整性，對生殖干細(xì)胞的自我更新、配子和胚胎的發(fā)育具有重要的作用［5-6］。由于Piwil2基因可特異性的表達(dá)在腫瘤干細(xì)胞和腫瘤前體細(xì)胞中，因此其可能與小RNA相互作用，從而在腫瘤的表觀遺傳學(xué)修飾中發(fā)揮重要作用。研究［7］顯示Piwil2表達(dá)增加和DNA高甲基化呈正相關(guān)，導(dǎo)致相應(yīng)抑癌基因如細(xì)胞色素依賴激酶的表達(dá)沉默，而用DNA甲基化酶抑制劑可減少腫瘤整體的甲基化水平而抑制腫瘤的增殖。另外Piwil2表達(dá)增加可以上調(diào)Stat3和Bcl基因表達(dá)，抑制p53蛋白的表達(dá)，同時Piwil2可以和NF-κB共同表達(dá)在細(xì)胞核中，使細(xì)胞從G0／M期進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤惡性增殖，而抑制Piwil2表達(dá)可恢復(fù)p53的水平使腫瘤細(xì)胞的G2／M期細(xì)胞減少，使腫瘤增殖抑制［8］。p53與NF-κB信號通路通常與細(xì)胞衰老途徑等密切相關(guān)，這些都說明Piwil2基因作為一種癌基因在促進(jìn)腫瘤增殖中具有重要的作用，但其具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究和論證。

為了研究Piwil2基因在宮頸癌中的具體作用，本實驗運用shRNA轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞特異性沉默Piwil2基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA后Piwil2的表達(dá)水平明顯降低，說明建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sh-piwil2的宮頸癌細(xì)胞。細(xì)胞增殖實驗表明沉默Piwil2組細(xì)胞的增殖能力較對照組明顯下降，其中C33A細(xì)胞在72 h可發(fā)生明顯的增殖抑制，而Hela細(xì)胞在48 h即可發(fā)生明顯的抑制，這可能與兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默的效率不同有關(guān)；集落形成實驗亦顯示沉默Piwil2后兩組宮頸癌細(xì)胞的集落形成數(shù)均較對照組明顯減少，表明抑制Piwil2表達(dá)可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期的變化，可以看出兩組Sh-piwil2宮頸癌細(xì)胞的G0／G1期比例明顯上升，S期的比例減少，而G2／M則變化不明顯，從而進(jìn)一步證明沉默Piwil2可以使細(xì)胞周期阻滯在G0／G1期，繼之細(xì)胞衰老實驗證明沉默Piwil2組細(xì)胞的衰老數(shù)增多，表明沉默Piwil2基因可以抑制細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致

細(xì)胞的衰老，使宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為發(fā)生一定程度的逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，本研究證實Piwil2基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，運用shRNA可以特異性沉默Piwil2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞衰老增多。這與前期實驗研究［9］顯示Piwil2基因過表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)論相符合，并且進(jìn)一步證明Piwil2表達(dá)增加與腫瘤細(xì)胞衰老呈負(fù)相關(guān)。另外抑制Piwil2蛋白表達(dá)可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且可以增加腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性［10-11］，由此推測Piwil2基因有可能作為宮頸癌臨床治療的一個潛在作用靶點，這為后續(xù)的基礎(chǔ)研究和進(jìn)一步臨床治療研究提供了理論依據(jù)。

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Silencing of Piwil2 expression on the proliferation and senescence of cervical cancer cells

Zhang Hongli1，F(xiàn)eng Dingqing2，Ling Bin1，3，et al
（1Dept of Obstetrics and Gynecology，2Molecular Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；3Dept of Obstetrics and Gynecology，China-Japan Friendship Hospital，Bejing 100086）

AbstractObjective To explore the effect of silencing Piwil2 gene by shRNA on the proliferation and senescence of cervical cancer cells.Methods Constructed the stable Sh-piwil2 cervical cancer cells via Lipofectamine2000 mediation and puromycin selection.The efficiency of transfection was confirmed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western blot.Cell proliferation assay，colony forming assay，cell cycle assay and cell senescence assay were detected the influence of silencing Piwil2 gene on the biological behavior of cervical cancer cells.Results The stable Sh-piwil2 cervical cancer cells were constructed.Compared with the Vector groups，the growth and colony forming rate were significantly decreased.Moreover，the cell cycle was arrested in the G0／G1 phase and the cell senescence was increased through silence the expression of Piwil2 gene.Conclusion Silencing Piwil2 gene can effectively suppress cell proliferation of cervical cancer cells.We speculate that Piwil2 gene may become a potential target in clinical therapy for cervical cancer.

Key wordscervical cancer；shRNA；Piwil2；cell proliferation；cell senescence

作者簡介：張紅麗，女，碩士研究生；凌 斌，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lingbin.ling＠gmail.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81372777、81372779、81072127）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）05-0589-05

中圖分類號R 737.33