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線粒體ATP敏感性鉀通道開放對大鼠肺缺血-再灌注損傷的保護作用*

**通信作者 E-mail:mzlcf2008@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150420.1829.003.html

李濤1， 賴春鳳2**， 曾茂森1， 陸德琴3

(1.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室， 廣東 梅州514031； 2.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 內(nèi)科學(xué)教研室， 廣東 梅州514031； 3.貴陽醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)開放對大鼠肺缺血-再灌注損傷(I/R)的保護作用。方法： 建立大鼠肺I/R模型，設(shè)立假手術(shù)組、肺I/R組、mitoKATP開放劑二氮嗪(DE)+I/R組、mitoKATP阻斷劑5-羥基葵酸(5-HD)+DE+I/R組，每組10只大鼠；檢測各組肺組織濕/干重比，HE染色法觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色法檢測肺組織細胞色素C的表達，TUNEL法檢測肺細胞凋亡指數(shù)。結(jié)果： 與假手術(shù)組相比，I/R組肺組織濕/干重比明顯增加(P<0.05)，肺組織出現(xiàn)出血、水腫等損傷性病理學(xué)變化，細胞色素C表達明顯增多(P<0.01)、肺細胞凋亡指數(shù)明顯增大(P<0.01)；與I/R組相比，DE+I/R組肺組織濕/干重比明顯降低(P<0.05)、肺組織損傷性病理變化明顯減輕、肺細胞色素C表達明顯減少(P<0.05)、細胞凋亡指數(shù)明顯減小(P<0.05)，而5-HD+DE+ I/R組各項指標與I/R組比較無差異(P>0.05)。結(jié)論： mitoKATP的開放可減輕肺水腫、抑制細胞凋亡，對大鼠肺缺血-再灌注損傷具有保護作用。

[關(guān)鍵詞]肺；缺血；再灌注損傷；線粒體ATP敏感性鉀通道；細胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley

近年來，隨著體外循環(huán)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，肺缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，I/R)所導(dǎo)致的肺功能障礙受到重視。低氧或缺血預(yù)處理(hypoxic/ischemic preconditioning，HPC/IPC)是抗臟器I/R有效防治手段之一，而線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)被認為是IPC的觸發(fā)因子和后期保護作用的終末效應(yīng)因子。mitoKATP開放對低氧性肺損傷具有保護作用。本實驗觀察mitoKATP開放預(yù)處理對大鼠肺I/R的保護作用及其機制，為I/R的機制及其防治提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物成年SD大鼠40只，體質(zhì)量180~210 g，雌雄不拘，由汕頭大學(xué)動物實驗中心提供。常規(guī)飲食，自由飲水。

1.1.2主要試劑及儀器mitoKATP開放劑二氮嗪(DE，sigma公司)、阻斷劑5-羥癸酸(5-HD，sigma公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL法)、鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶法(SABC法)試劑盒、DAB顯色試劑盒、細胞色素C抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，CMS顯微鏡(日本Leica)，BX41圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS)。

1.2　方法

1.2.1大鼠肺I/R模型復(fù)制10%水合氯醛0.2 mL/100 g腹腔麻醉，氣管插管，接動物呼吸機。經(jīng)左前胸第5肋間開胸，解剖左側(cè)肺門，用鹽水稀釋肝素50 U至500 μL經(jīng)尾靜脈注入，5 min后于肺充盈末用手術(shù)絲線通過肺門雙活結(jié)套扎左肺門，45 min后開放，再灌注120 min。假手術(shù)組左肺門穿線不結(jié)扎。實驗結(jié)束后切取左肺備用。

1.2.2實驗分組(1)假手術(shù)組：開胸后游離左肺門，穿線不結(jié)扎，不進行其他處理。(2)I/R組：用手術(shù)絲線通過肺門雙活結(jié)套扎左肺門，45 min后開放，再灌注120 min。(3)DE+I/R組：在缺血前30 min腹腔注入DE 10 mg/kg后，按(2)進行處理。(4)5-HD+DE+I/R組：先給予5-HD 10 mg/kg靜脈注射，15 min后給予DE 10 mg/kg腹腔注入，30 min后再按(2)處理。以上4組每組10只。

1.2.3標本的采集和處理實驗結(jié)束時，取出大鼠左肺，切取中下段肺組織，置于新鮮10%中性緩沖福爾馬林中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，供HE染色、免疫組織化學(xué)染色及細胞凋亡檢測。

1.2.4肺組織細胞色素C免疫組織化學(xué)(SABC法)檢測。切片置3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化酶，檸檬酸鹽緩沖液中中高火進行抗原修復(fù)，滴加1∶120的一抗過夜后加入山羊抗兔IgG，DBA顯色，細胞漿呈棕黃色判定為細胞色素C陽性表達。于400×顯微鏡下隨機取5個細胞總數(shù)超過200的視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，計算陽性細胞率(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)。

1.2.5肺細胞凋亡TUNEL法檢測。在普通光學(xué)顯微鏡下凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)棕黃色判定為陽性細胞，無細胞凋亡不顯色則為陰性。在400×倍顯微鏡下任取5個細胞總數(shù)200個以上的視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及細胞總數(shù)，并計算細胞凋亡指數(shù)(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下，可見假手術(shù)組肺泡腔內(nèi)無水腫、充血及壞死，間隔無增寬，無炎細胞浸潤，結(jié)構(gòu)清晰可見(圖1-A)。I/R組肺泡腔內(nèi)可見明顯的充血、水腫，血管擴張及炎細胞浸潤，并有局灶性肺氣腫，肺泡間隔增寬，偶見局灶性的壞死灶，組織、細胞結(jié)構(gòu)紊亂(圖1-B)。DE+I/R組可見少量的炎性細胞浸潤，無明顯的充血、水腫，組織、細胞損傷程度較I/R組明顯減輕，與對照組相似(圖1-C)。而5-HD+DE+I/R組亦可見明顯 的充血、水腫，肺氣腫及炎性細胞浸潤等，表現(xiàn)出近似I/R組的病理改變(圖1-D)。

2.2　肺組織濕/干重比

與假手術(shù)組相比，I/R組及5-HD+DE+I/R組肺濕/干比顯著增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而DE+I/R組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組相比，DE+I/R組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明mitoKATP開放劑能夠減輕肺組織損傷，減輕肺水腫，而使用mitoKATP抑制劑后可阻斷此保護作用。見表1。

表1　各組大鼠肺組織濕/干重比的變化±s)

(1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；(2)與I/R組比較，P<0.05

2.3　肺組織細胞色素C和凋亡指數(shù)

I/R組及5-HD+DE+I/R組肺組織細胞色素C的陽性細胞率均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與I/R組相比，DE+I/R組陽性細胞率明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而5-HD+DE+I/R組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1。假手術(shù)組大鼠的肺組織僅偶見細胞凋亡的發(fā)生，I/R組及5-HD+DE+I/R組肺細胞凋亡指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；與I/R組相比，DE+I/R組肺細胞凋亡指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

3討論

I/R普遍發(fā)生于各個組織器官，大量實驗證明與假手術(shù)組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05；(3)與I/R組比較，P<0.05I/R可加重心、腦、腎、腸、肺等器官損傷，是影響缺血治療效果的一個重要因素。再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜，氧自由基的作用、鈣超載、中性粒細胞、細胞凋亡和補體激活等均可能參與了再灌注損傷的發(fā)病過程[3-4]。肺I/R常常發(fā)生于心肺復(fù)蘇、體外循環(huán)、肺栓塞、肺切除、肺移植等情況下，是影響術(shù)后肺組織功能恢復(fù)的關(guān)鍵性因素。肺I/R后病理改變主要是肺泡-毛細血管通透性增高，中性粒細胞滲出、蛋白漏出、肺間質(zhì)與肺泡水腫，肺濕/干比增加，組織炎癥與細胞損傷，以及肺細胞凋亡與壞死等，從而導(dǎo)致肺功能明顯降低。本實驗結(jié)果顯示肺經(jīng)I/R后，光鏡下可見肺泡腔內(nèi)可見明顯的出血、水腫，炎性細胞浸潤，組織、細胞結(jié)構(gòu)紊亂，肺組織損傷明顯；肺濕/干重比較假手術(shù)組明顯增高。

表2　各組肺組織細胞色素C陽性

實驗和臨床資料表明，HPC/IPC是減輕臟器I/R的有力防治措施，研究大多涉及心臟和腦組織，在本課題組之前的研究中也表明HPC對大鼠肺缺血再灌注損傷有保護作用，認為是細胞線粒體釋放了細胞色素C，抑制細胞凋亡從而保護肺I/R損傷[6-8]。

研究表明，在低氧HPC對抗低氧性肺損傷的保護作用機制中線粒體ATP敏感性鉀通道起到了重要的作用，研究中發(fā)現(xiàn)mitoKATP的開放劑DE可以提高肺泡液體清除率，減輕肺水腫和肺損傷，而特異性抑制劑5-HD和格列苯脲可以阻斷DE的保護作用。提示mitoKATP的開放對肺I/R也具有保護作用。為了進一步驗證這一觀點，本研究應(yīng)用DE進行HPC/IPC，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DE對肺I/R有明顯的保護作用，與I/R組相比，光鏡下可見肺損傷性病理形態(tài)學(xué)改變明顯減輕，肺/干重比明顯下降。當(dāng)應(yīng)用5-HD關(guān)閉mitoKATP后，與DE組相比，光鏡下肺組織損傷加重，肺濕/干重比明顯升高。實驗表明DE能夠減輕I/R所引起的肺損傷、肺水腫，5-HD有阻斷DE的作用加重肺損傷。

A為假手術(shù)組，B為I/R組，C為DE+I/R組，D為5-HD+DE+I/R組圖1　肺組織細胞色素C表達(SABC,×400)Fig.1　Expression of cytochrome C in rat lung tissues of different groups (SABC,×400)

A為假手術(shù)組，B為I/R組，C為DE+I/R組，D為5-HD+DE+I/R組圖2　肺組織細胞凋亡( TUNEL, ×400)Fig.2　Lung tissue sections of different groups showing different amount of apoptosis cells(TUNEL,×400)

實驗還發(fā)現(xiàn)，肺I/R后肺組織細胞色素C的陽性表達率明顯增加，肺細胞凋亡指數(shù)也明顯增加，DE預(yù)處理可顯著降低肺組織細胞色素C的陽性表達率和細胞凋亡指數(shù)，而預(yù)先應(yīng)用5-HD后則肺組織細胞色素C陽性表達率增加，肺組織細胞凋亡明顯，且與I/R組相比無顯著性差異。這可能是由于DE引起mitoKATP開放和線粒體膜電位Δψm部分去極化，減少了細胞色素C從線粒體釋放入胞漿，從而減少肺動脈平滑肌細胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，mitoKATP的開放可以減輕肺I/R所致的肺損傷、肺水腫，還可通過抑制線粒體細胞色素C釋放至胞漿、抑制肺組織細胞凋亡對肺I/R損傷的發(fā)揮保護作用。

4參考文獻

[1] Ambros JT, Herrero-Fresneda I, Borau OG, et al. Ischemic preconditioning in solid organ transplantation: from experimental to clinics [J]. Transplant International, 2007(20):219-229.

[2] 胡煬琳,萬笑笑,羅丹,等.線粒體ATP敏感鉀通道在低氧預(yù)處理抗低氧性肺損傷中的作用[J].華中醫(yī)學(xué)雜志, 2006(5):353-354,366.

[3] Lopera YE,Fantinelli J,Gonzalez-Arbelaez LF,et al.Antioxidant activity and cardiopr-otecive effect of a nonalcoholic extract of caccinium meridionale Swartz during isch- emia-reperfusion in rats[J].Evid Based Complement Alternat Med, 2013(2013):1115-1165.

[4] Ginsburg KS, Weber CR, Bers DM.Cardiac Na+-Ca2+exchanger:dynamics of Ca2+-dependent actication and deactivation in intact myocytes[J].J Physiol, 2013(Pt-8):2067-2086.

[5] Den Hengst WA,Gielis JF,Lin JY,et al.Lung ischemia-reperfusion injury:a molecu-lar and clinical view on a complex pathophysiological process[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, 2010(5):1283-1299.

[6] 李濤,陳瑩,陸德琴,等.大鼠整體低氧預(yù)處理減輕肺缺血再灌注損傷[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008(6):632-634,639.

[7] 陳瑩,陸德琴,李濤,等.整體低氧預(yù)處理對大鼠肺組織細胞色素C表達和細胞凋亡的影響[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2009(5):504-507.

[8] 陸德琴,陳瑩,李濤,等.大鼠整體低氧預(yù)處理對在體肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].重慶醫(yī)學(xué), 2010(15):1960-1962.

(2015-01-05收稿，2015-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Protective Effects of Opening of Mitochondrial ATP Sensitive Potassium

Channel on Ischemia-reperfusion Injury in Rat Lunginvivo

LI Tao1, LAI Chunfeng2, ZENG Maosen1, LU Deqin3

(1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,MedicalCollegeofJiayingCollege,Meizhou514031,Guangdong,China;

2.DepartmentofInternalmedicine,MedicalCollegeofJiayingCollege,Meizhou514031,Guangdong,China;

3.DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege，Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effect of opening of mitochondrial ATP sensitive potassium channel on lung ischemia-reperfusion injury in rats. Methods: Pulmonary ischemia-reperfusion injury rat model was established by left hilar ligation and reperfusion. Preconditioning was conducted by using the mitochondrial ATP sensitive potassium channel opener (diazoxide, DE). Forty rats were randomly divided into four groups (n=10, respectively), i.e. sham-operation group, I/R group, DE+I/R group and 5-HD+DE+I/R group. The ratio of wet/dry weight of lung tissue and morphological change were observed. Cytochrome C expression and apoptosis index in lung tissue were assessed by immunohistochemical staining and TUNEL methods, respectively. Results: Compared with sham-operation group, the wet/dry weight ratio of lung tissue in I/R group was significantly increased(P<0.05), the pathological changes such as hemorrhage and edema in lung tissue, the expression of cytochrome C increased significantly(P<0.01) and the lung cell apoptosis index increased significantly. Compared with I/R group, the wet/dry weight ratio of lung tissue in DE+I/R group was significantly decreased(P<0.05), the pathological changes in lung tissue were obviously alleviated, the expression of cytochrome C decreased significantly(P<0.01) and the lung cell apoptosis index decreased significantly(P<0.01). There was no difference in above-mentioned indexes between I/R group and 5-HD+I/R group(P>0.05). Conclusion: The opening of mitochondrial ATP sensitive potassium channel can effectively alleviate pulmonary edema, inhibit apoptosis and play a protective role in the injury of lung ischemia-reperfusion in vivo.

[Key words]lung; ischemia； reperfusion injury; mitochondrial ATP sensitive potassium channel；apoptosis; rats，Sprague-Dawley

[中圖分類號]R363.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2015)04-0356-04

*[基金項目]廣東省梅州市科技局計劃項目(2007B17)