趙菲佚,焦成瑾,田春芳,王太術(shù),謝尚強(qiáng),何麗娟

(天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅天水 741001)

擬南芥乙酰羥酸合成酶(AHAS)點(diǎn)突變?cè)吮磉_(dá)與活性測(cè)定

趙菲佚,焦成瑾,田春芳,王太術(shù),謝尚強(qiáng),何麗娟

(天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅天水 741001)

擬南芥乙酰羥酸合成酶(AHAS)參與支鏈氨基酸合成。為考察AHAS不同結(jié)構(gòu)域?qū)χф湴被岷铣傻挠绊?分別對(duì)其大小亞基上特定位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后進(jìn)行原核表達(dá),體外重組后對(duì)其全酶活性進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其終端產(chǎn)物之一——纈氨酸對(duì)AHAS全酶活性的影響進(jìn)行探討。結(jié)果顯示:AHAS小亞基G88D突變將解除其終端產(chǎn)物的反饋抑制作用,而大亞基E305D與E482D的突變降低AHAS全酶活性,且2種不同突變大亞基對(duì)AHAS全酶活性影響存在差異。AHAS大亞基E482D突變較E305D突變影響更大。研究結(jié)果表明:AHAS大小亞基間存在著相互作用,且大小亞基不同結(jié)構(gòu)域突變對(duì)AHAS全酶活性具有不同的影響。

乙酰羥酸合成酶;點(diǎn)突變;原核表達(dá);全酶活性

纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸由于具有支鏈碳骨架而被稱(chēng)為支鏈氨基酸。支鏈氨基酸參與動(dòng)物生長(zhǎng)與發(fā)育諸多代謝過(guò)程[1-3]。在動(dòng)物細(xì)胞中,支鏈氨基酸通過(guò)信號(hào)蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)進(jìn)行信號(hào)傳遞,通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)蛋白合成及降解過(guò)程在蛋白質(zhì)合成中起著重要的作用。此外,支鏈氨基酸也直接或間接影響興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的合成與區(qū)室化過(guò)程[4],對(duì)胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、兒茶酚胺類(lèi)多巴胺和去甲腎上腺素的合成也有影響[2,5]。由于動(dòng)物不能從頭合成支鏈氨基酸,只能通過(guò)飲食獲取,使植物成為支鏈氨基酸的重要來(lái)源。

在植物、細(xì)菌及真菌中,支鏈氨基酸通過(guò)非常保守的代謝途徑進(jìn)行合成,合成過(guò)程受合成酶底物及合成途徑終產(chǎn)物的嚴(yán)格調(diào)控[6]。乙酰羥酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)也稱(chēng)乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase),是該代謝途徑第一個(gè)酶,催化兩分子丙酮酸鹽生成纈氨酸和亮氨酸的前體物質(zhì)乙酰乳酸;也能催化丙酮酸鹽與α-酮丁酸生成異亮氨酸前體乙酰羥基丁酸鹽[7]。由于AHAS可作為一些化學(xué)除草劑的靶點(diǎn),其結(jié)構(gòu)與功能在不同生物中已有較好研究。細(xì)菌AHAS全酶為四聚體,由2個(gè)較大的催化亞基和2個(gè)較小的調(diào)節(jié)亞基組成,小亞基可穩(wěn)定并增強(qiáng)催化亞基的活性[8],包含1個(gè)保守的ACT結(jié)構(gòu)域,大亞基則介導(dǎo)終產(chǎn)物的反饋抑制作用。對(duì)植物AHAS研究表明:植物AHAS大小是細(xì)菌的2倍,催化亞基含有2個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域,推測(cè)植物AHAS的構(gòu)象可能與細(xì)菌不同[9]。

基于植物AHAS在支鏈氨基酸代謝中的關(guān)鍵作用,研究者試圖過(guò)表達(dá)該基因各自的亞基來(lái)提高植物體內(nèi)的支鏈氨基酸含量,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果均未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)[10-11]。對(duì)細(xì)菌AHAS大亞基的研究確定了H132、K155、E213、D217、E221、E389、E393和S414為其關(guān)鍵位點(diǎn),除E213D外,其余位點(diǎn)的突變使細(xì)菌AHAS酶活性完全喪失,E213D的突變使細(xì)菌AHAS的酶活性只有野生型酶蛋白的25%[12]。波菜AHAS大亞基體外突變分析結(jié)果與細(xì)菌相似,大亞基R2598、E311、D315、E319、E488、E492、S518和T520組成AHAS的活性中心,除E488D突變外,其它突變均消除了該酶活性,E488D突變使其酶活性為野生型的48%[13]。對(duì)AHAS氨基酸序列在不同物種間的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),細(xì)菌E213與擬南芥E305對(duì)應(yīng),而波菜E488與擬南芥E482相對(duì)應(yīng)。細(xì)菌AHAS小亞基ilvH中,N11A、G14D、N29H、T34L、A36V及Q59L突變對(duì)細(xì)菌AHAS全酶活性與對(duì)纈氨酸的敏感性有影響,其中G14D突變具有野生型AHAS酶活性的92%,并使細(xì)菌具有對(duì)纈氨酸最強(qiáng)烈的抗性,比對(duì)發(fā)現(xiàn)此突變與擬南芥小亞基G88D突變相對(duì)應(yīng)[14]。

近期Chen等[15]通過(guò)正向遺傳學(xué)篩選到擬南芥突變體vat1(valine-tolerant 1),并發(fā)現(xiàn)催化亞基的T119L突變可解除終產(chǎn)物抑制,使支鏈氨基酸含量增加。植物AHAS全酶催化亞基與調(diào)節(jié)亞基間存在著相互作用,進(jìn)而影響AHAS催化活性。已有研究多集中于對(duì)AHAS各自亞基功能的探討,對(duì)大小亞基上關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域同時(shí)突變,并從全酶水平進(jìn)行活性研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)擬南芥AHAS兩亞基不同位置進(jìn)行體外突變,然后在原核細(xì)胞中分別表達(dá),不同突變亞基蛋白經(jīng)體外重組后測(cè)定AHAS全酶活性變化。研究結(jié)果在理論上將為了解AHAS亞基間相互作用提供信息,實(shí)踐上將為提高支鏈氨基酸含量的基因操作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥野生型(Columbia-0)訂購(gòu)自SALK(http://signal.salk.edu/)。種子用含0.1% TritonX-100的20%次氯酸鈉消毒液在EP管中消毒12 min,滅菌ddH2O漂洗5次后,點(diǎn)種于MS固體培養(yǎng)基平板上。置于4 ℃下春化2～3后移至22 ℃連續(xù)光照條件下豎直培養(yǎng)。

1.2 AHAS點(diǎn)突變?cè)吮磉_(dá)載體構(gòu)建

平板上生長(zhǎng)7 d的擬南芥整株幼苗,提取其總RNA,采用上海生物工程公司總RNA提取試劑盒進(jìn)行(Sangon,SK1312),提取的總RNA使用invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄(invitrogen,18080-093),以cDNA為模板,使用高保真酶進(jìn)行AHAS大小亞基CDS全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增(Trans,AP221-01)。野生型AHAS大亞基使用引物ALUF(5′-CCGGAATTCATGGCGGCGGCTA-CTTCATCCATC-3′)和ALUR(5′-CCCAAGCTT-TCAGTTGCTAGATTGACGCAAC-3′);野生型AHAS小亞基使用ASUF(5′-CGCGGATCCATGGCGGCGACGACGACTGCTAC-3′)和ASUR(5′-CCCAAGCTTCTACAAAGGAAGAGAGTATCC-ACG-3′);AHAS大亞基在第305位E305D的正向突變引物為ALU305F(5′-ACTCTTGAACAGGA-TTACAGGAGTGAC-3′),反向突變引物ALU305R(5′-GTCACTCCTGTAATCCTGTTCAAGAGT-3′);AHAS大亞基第482位E482D正向突變引物為ALU482F(5′-CACTCTTACTCAGATATCATC-AACGAG-3′),反向引物為ALU482R(5′-CTCGT-TGATGATATCTGAGT AAGAGTG-3′)。AHAS小亞基第88位G88D正向突變引物ASU88F(5′-GGCGATGAGAGCGATATAATAAATAGA-3′),反向突變引物為ASU88R(5′-TCTATTTATTATATCGCTCTCATCGCC-3′)。引物中下劃線標(biāo)記各酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收柱(Sangon,SK8132)純化后雙酶切,再次純化后連接到pET28a表達(dá)載體上,所有克隆序列送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序,確認(rèn)克隆正確后分別進(jìn)行AHAS大小亞基蛋白原核表達(dá)。

1.3 AHAS突變大小亞基蛋白原核表達(dá)

將測(cè)序正確的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株,按1∶1 000的比例接種至60 mL含50 μg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃過(guò)夜小量培養(yǎng)。次日將10 mL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1 L含50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)菌液OD600達(dá)0.6時(shí)收菌,4 000 r/min離心,沉淀加入30 mL裂解液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH 8.0)重懸,在超聲破碎儀上破碎后12 000 r/min離心,上清液中加入Qiagen公司Ni-NTA樹(shù)脂,重組蛋白提取按Qiagen公司樹(shù)脂使用方法進(jìn)行。純化蛋白保存于4 ℃冰箱備用。

1.4 AHAS突變大小亞基蛋白體外重組與全酶活性測(cè)定

AHAS蛋白酶大小亞基體外重組與全酶活性測(cè)定按照Maria Vyazmensky的方法進(jìn)行[8],并依據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行部分修改[16-17]。野生型及各突變等量AHAS大小亞基蛋白(500 μg)加入500 μL重組緩沖液A(0.1 mmol/L FAD,10 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液,pH 7.6)中。37 ℃保溫15 min使AHAS大小亞基進(jìn)行重組,后加入500 μL緩沖液B(80 mmol/L丙酮酸鈉,0.2 mmol/L TPP,20 mmol/L MgCl2,0.05 mmol/L FAD,1 mmol/L DTT,10 mmol/L EDTA溶解于0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液中,pH 7.6),至已保溫完全的緩沖液A中開(kāi)始反應(yīng)。此反應(yīng)混合液在37 ℃保溫30 min后加入1/10總反應(yīng)體積的10% H2SO4以終止反應(yīng),在60 ℃下加熱15 min使乙酰乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-2-丁酮,再加入120 μL 1.7% 肌酸,使用2.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液至堿性,后加入140 μL α-奈酚,60 ℃保溫15 min使其顯色。反應(yīng)生成的3-羥基-2-丁酮使用CARY 50 Bio分光光度計(jì)在525 nm下進(jìn)行比色測(cè)定。在此反應(yīng)條件下,一個(gè)酶活力單位定義為1 μmol乙酰乳酸在1 min內(nèi)生成的產(chǎn)物。測(cè)定重復(fù)3次,計(jì)算均值與標(biāo)準(zhǔn)差。外源加入纈氨酸對(duì)AHAS酶活性影響測(cè)定方法除在緩沖液B中加入所需濃度的纈氨酸外,其余步驟與上述標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHAS蛋白結(jié)構(gòu)及其突變位置

擬南芥AHAS全酶由2個(gè)相同的大亞基和2個(gè)相同的小亞基構(gòu)成,大亞基為催化亞基,小亞基為調(diào)節(jié)亞基。AHAS大亞基(ALU)定位于擬南芥第5條染色體上(At5g58610),其CDS共有1 773 bp,編碼蛋白含591個(gè)氨基酸。蛋白第305位氨基酸由E轉(zhuǎn)變?yōu)镈,導(dǎo)致第一個(gè)大亞基突變蛋白為ALUE305D,第482位氨基酸由E轉(zhuǎn)變?yōu)镈形成該大亞基第二個(gè)突變蛋白ALUE482D(圖1,A)。AHAS小亞基(ASU)定位于擬南芥第3條染色體上(At3g16290),其CDS其有1 441 bp,共編碼477個(gè)氨基酸,屬于ACT超家族。小亞基蛋白包含2個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域,分別位于78～150和309～383氨基酸區(qū)域。蛋白第88位氨基酸由G轉(zhuǎn)變?yōu)镈形成小亞基突變蛋白ASUG88D(圖1,B)。

2.2 AHAS原核表達(dá)載體構(gòu)建

ALU野生型與ALU第305位E突變?yōu)镈的ALUE305D、第482位E突變?yōu)镈的ALUE482D突變蛋白和ASU野生型及ASU第88位G突變?yōu)镈的ASUG88D突變蛋白CDS以PCR方式進(jìn)行擴(kuò)增,并被克隆到原核表達(dá)載體pET28a中(圖2)。從圖2可看出,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與AHAS大小亞基片段大小相符合,大亞基片段大小為1.7 kb,小亞基大小約1.4 kb。擴(kuò)增片段連接到pET28a后經(jīng)酶切驗(yàn)證克隆正確,用于后續(xù)表達(dá)試驗(yàn)。

圖1 AHAS蛋白大小亞基結(jié)構(gòu)與突變位置示意A.ALU結(jié)構(gòu)與突變位置;B.ASU結(jié)構(gòu)與突變位置;圖中數(shù)字表示從翻譯起點(diǎn)處氨基酸位置;ACT.ACT 結(jié)構(gòu)域

2.3 AHAS突變蛋白原核表達(dá)

將構(gòu)建并測(cè)序驗(yàn)證的AHAS大小亞基及其突變形式原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21(DE3)進(jìn)行大小亞基蛋白分別表達(dá),表達(dá)的不同形式蛋白經(jīng)His標(biāo)簽純化,經(jīng)12% SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 AHAS大小亞基及其突變形式原核表達(dá)載體構(gòu)建M1.DL2000;M2.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ;1～5 分別為ALU、ASU、ALUE305D、ALUE482D及ASUG88D;6～10分別為1～5 PCR產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pET28a后經(jīng)BamHⅠ與SalⅠ雙酶切鑒定

圖3,A顯示,ALU及其2種突變形式ALUE305D、ALUE482D均得到正確表達(dá),其大小都在其預(yù)測(cè)的65 kD。從圖3,B可看出,ASU及ASUG88D也得到了表達(dá),預(yù)測(cè)大小為53 kD,然而小亞基的表達(dá)除有一條表達(dá)主帶外,還有其它非特異性條帶存在。為進(jìn)一步確認(rèn)AHAS大小亞基表達(dá)的正確性及小亞基的正確位置,對(duì)所純化的蛋白使用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western檢測(cè)(圖3,C)。結(jié)果表明,AHAS大小亞基均為His融合蛋白,其與預(yù)測(cè)大小符合,且AHAS小亞基位于非特異性條帶下方。

2.4 AHAS突變蛋白體外重組與全酶活性測(cè)定

為考察AHAS各亞基不同點(diǎn)突變形式對(duì)其全酶活性的影響,對(duì)已在原核中表達(dá)的AHAS亞基的不同突變形式在體外進(jìn)行重組,并對(duì)重組的全酶活性及不同纈氨酸濃度對(duì)全酶活性影響進(jìn)行了測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4表明,當(dāng)AHAS大亞基第305位或其第482位由谷氨酸變?yōu)樘於彼?E突變?yōu)镈),而小亞基第88位由甘氨酸變?yōu)樘於彼釙r(shí)(G突變?yōu)镈),不同的大亞基突變形式與突變的小亞基重組后依然表現(xiàn)出酶活性,但不同的突變大亞基形式與突變小亞基組合對(duì)其全酶活性的影響不同。與未突變的野生型全酶相比較,發(fā)生點(diǎn)突變后的全酶活性均降低,下降最快的為大亞基發(fā)生E482D的突變形式(圖4,A,紅色柱),說(shuō)明當(dāng)AHAS的大小亞基不同結(jié)構(gòu)域突變會(huì)對(duì)其全酶活性產(chǎn)生影響。為考察纈氨酸對(duì)不同突變形式AHAS酶活性的影響,在不同突變形式的重組體系中加入終濃度為1 mmol/L纈氨酸,并對(duì)此條件下AHAS酶活性進(jìn)行了測(cè)定(圖4,A,綠色柱)。與無(wú)纈氨酸加入時(shí)不同,測(cè)試體系中存在纈氨酸時(shí),AHAS野生型蛋白酶活性受到抑制,而突變形式AHAS酶活性被抑制的程度小于其未突變的酶形式。在大亞基2種不同突變形式中,大亞基E305D突變形式酶活性被抑制的程度最小。此結(jié)果一方面說(shuō)明,當(dāng)AHAS小亞基發(fā)生G88D突變時(shí)的確部分解除了其終端產(chǎn)物對(duì)全酶的抑制作用,另一方面說(shuō)明在小亞基與大亞基同時(shí)存在突變時(shí),大亞基上的突變又可部分減弱由于小亞基突變導(dǎo)致的其終端產(chǎn)物對(duì)酶活性的影響,且在大亞基不同位置的點(diǎn)突變對(duì)此減弱的程度存在差異。

圖3 AHAS大小亞基及其突變蛋白表達(dá)與純化A.ALU、ALUE305D和ALUE482DHis標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)與純化;B.ASU及ASUG88DHis標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)與純化;C.ASU與ASUG88DHis標(biāo)簽融合蛋白Western檢測(cè),圖中上部為純化蛋白考馬斯亮藍(lán)染色(CBB),下部為His標(biāo)簽抗體雜交結(jié)果

圖4 突變ALU與ASU重組酶不同纈氨酸濃度下活性A.突變ALU與ASU重組全酶活性;B.不同濃度纈氨酸處理下突變ALU與ASU重組全酶活性

此外,對(duì)不同AHAS突變形式在不同濃度纈氨酸存在時(shí)對(duì)其活性影響也進(jìn)行了測(cè)定(圖4,B),結(jié)果表明,在不同纈氨酸濃度下,野生型及突變形式AHAS活性均隨著纈氨酸濃度的升高而降低,野生型AHAS的活性降幅最大,在纈氨酸0～0.01 mmol/L區(qū)間內(nèi),降幅達(dá)65%,而突變形式的AHAS在此區(qū)間內(nèi)的降幅與野生型相比則較小,大亞基E482D突變的降幅為38.1%,而E305D的突變降幅僅為11.7%。在纈氨酸從0～4 mmol/L區(qū)間內(nèi),野生型AHAS活性的降幅平均為87.1%,E305D的平均為70.5%,E482D為80.8%。此結(jié)果說(shuō)明,當(dāng)存在不同濃度纈氨酸終產(chǎn)物時(shí),其對(duì)AHAS活性的抑制由于AHAS在大亞基上不同位置的突變而有差異,與其在1 mmol/L濃度下的測(cè)定結(jié)果相似,在不同濃度纈氨酸影響下,呈現(xiàn)出突變形式AHAS活性下降較野生型小,而在2種突變形式AHAS中,E305D對(duì)終產(chǎn)物的反饋抑制影響又較E482D小,且纈氨酸對(duì)AHAS活性的抑制濃度集中于0～0.01 mmol/L的狹窄區(qū)間內(nèi)。

3 討 論

支鏈氨基酸是動(dòng)物的必需氨基酸,植物是這些氨基酸的主要來(lái)源。植物AHAS作為支鏈氨基酸合成途徑中的第一個(gè)酶,其活性變化與調(diào)節(jié)在支鏈氨基酸合成中起著關(guān)鍵性的作用。植物中提高此類(lèi)氨基酸含量無(wú)法以過(guò)表達(dá)該基因的方式實(shí)現(xiàn)[7,11],對(duì)AHAS酶蛋白精細(xì)結(jié)構(gòu)及活性調(diào)控研究成為實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的重要途徑。

本研究中,對(duì)擬南芥AHAS點(diǎn)突變大小亞基體外表達(dá)與活性測(cè)定表明:AHAS野生型及不同位置發(fā)生突變的大小亞基以融合蛋白方式在原核中均可進(jìn)行表達(dá),純化的原核表達(dá)大小亞基蛋白在體外可進(jìn)行重組,且全酶均表現(xiàn)出酶活性,然而在不同的突變方式下其全酶活性存在差異。在無(wú)纈氨酸存在時(shí),AHAS大亞基E305D或E482D與小亞基G88D突變組成的全酶與墅生型相比其活性均降低,其中E305D活性為野生型的74.4%,E482D為58.1%。當(dāng)AHAS大亞基不同結(jié)構(gòu)域特定位置發(fā)生點(diǎn)突變時(shí),其活性會(huì)降低,此結(jié)果與在細(xì)菌及波菜中的研究結(jié)果一致。然而,在擬南芥中,與細(xì)菌或波菜的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)突變后,其活性降低程度與細(xì)菌與波菜中不同。比對(duì)不同物種AHAS蛋白編碼序列發(fā)現(xiàn),其序列含有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,E305與E482處于第3與第4個(gè)結(jié)構(gòu)域中,在擬南芥中,兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上位點(diǎn)突變均導(dǎo)致酶活性的下降,但下降幅度與其它物種不同,此可能是由于擬南芥AHAS序列及其空間結(jié)構(gòu)上的不同所致。在細(xì)菌與波菜中,第3與第4結(jié)構(gòu)域在反應(yīng)中可結(jié)合鎂離子,第3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)后續(xù)還原反應(yīng),而第4結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)后續(xù)異構(gòu)化反應(yīng)過(guò)程[12-13]。當(dāng)在此兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上特定位點(diǎn)發(fā)生突變后,對(duì)AHAS活性在總趨勢(shì)為下降的同時(shí),也存在物種特異性。

AHAS小亞具有穩(wěn)定并調(diào)節(jié)大亞基活性的作用,也介導(dǎo)了支鏈氨基酸終端產(chǎn)物對(duì)全酶的活性調(diào)節(jié),盡管目前未發(fā)現(xiàn)小亞基結(jié)合支鏈氨基酸的直接證據(jù),但對(duì)酵母AHAS活性體外測(cè)定發(fā)現(xiàn),當(dāng)存在支鏈氨基酸時(shí),其大亞基活性的確會(huì)發(fā)生變化[18]。已有研究發(fā)現(xiàn),在支鏈氨基酸作為終端產(chǎn)物時(shí),在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸中,對(duì)其活性起主要影響的為纈氨酸,而其它兩種的影響較小[19]。本研究中,當(dāng)纈氨酸在體外活性測(cè)定體系中達(dá)1 mmol/L時(shí),對(duì)AHAS全酶活性影響與無(wú)纈氨酸時(shí)顯示出不同的效果,其對(duì)大亞基E305D突變酶活性影響較小,而對(duì)E482D的影響較大。不同纈氨酸濃度對(duì)AHAS野生型及突變形式全酶活性的影響測(cè)定中也發(fā)現(xiàn),其活性變化與在1 mmol/L濃度下的趨勢(shì)相同,在不同纈氨酸濃度下,野生型與突變形式AHAS全酶活性均受到終端纈氨酸的抑制,對(duì)突變形式的影響較野生型小,在2種大亞基突變形式中,E305D突變較E482D表現(xiàn)出對(duì)終端抑制更具有抗性,且此抑制效應(yīng)存在于0～0.01 mmol/L狹窄的濃度范圍內(nèi)。此抑制抗性效果顯然來(lái)源于AHAS小亞基G88D突變。已有研究顯示:當(dāng)此位點(diǎn)突變后可解除終端支鏈氨酸對(duì)AHAS的活性抑制作用,擬南芥AHAS小亞基與細(xì)菌不同,含有2個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域(細(xì)菌中僅含有一個(gè)),在細(xì)菌體內(nèi),AHAS更傾向于形成2個(gè)大亞基與2個(gè)小亞基的四聚體,而介導(dǎo)終端產(chǎn)物抑制位置存在于2個(gè)小亞基組成的二聚體界面上[20-22]。擬南芥中,由于小亞基含有兩個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域,其在調(diào)節(jié)大亞基活性的過(guò)程中與其它物種的不同,已有對(duì)小亞基不同ACT結(jié)構(gòu)域突變分析表明,其作用方式為在小亞基上的兩個(gè)ACT結(jié)構(gòu)域存在著分子內(nèi)的相互作用,2個(gè)ACT形成U型結(jié)構(gòu),且2個(gè)ACT在介導(dǎo)大亞基活性抑制中均起作用[15]。本研究結(jié)果表明,一方面當(dāng)小亞基特定位點(diǎn)(G88D)發(fā)生突變后消除了其對(duì)大亞基活性的反饋抑制作用,另一方面,由于大亞基上同時(shí)存在的突變使得其對(duì)大亞基活性的抑制影響又存在差異。

本研究中,對(duì)AHAS大小亞基同時(shí)進(jìn)行突變,在小亞基上突變可解除終端產(chǎn)物抑制的前提下考察大亞基不同位點(diǎn)對(duì)全酶活性的影響。已有研究中,AHAS小亞基可通過(guò)與大亞基解離與結(jié)合達(dá)到調(diào)節(jié)全酶活性目的?；诒狙芯拷Y(jié)果,可推測(cè)AHAS終端支鏈氨基酸對(duì)其活性影響來(lái)源于其全酶空間結(jié)構(gòu)變化,一方面,終端產(chǎn)物的結(jié)合可使AHAS小亞基空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,且不同濃度終產(chǎn)物對(duì)其結(jié)構(gòu)變化影響不同,另一方面結(jié)構(gòu)變化后的小亞基與大亞基的相互作用也將會(huì)對(duì)大亞基的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,而AHAS大亞基不同活性位點(diǎn)突變所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化也會(huì)反映于全酶最終活性上。對(duì)AHAS而言,可能存在不同位點(diǎn)突變產(chǎn)生的連續(xù)結(jié)構(gòu)變化和閾值效應(yīng),當(dāng)在一定空間變化范圍內(nèi),該結(jié)構(gòu)變化僅不同程度地影響全酶活性,而超過(guò)閾值后將完全消除其酶活性。不能排除在其大小亞基上是否存在已研究位點(diǎn)之外對(duì)AHAS活性可產(chǎn)生影響的其它位點(diǎn),對(duì)此推測(cè)的驗(yàn)證及AHAS突變后體內(nèi)功能評(píng)估是本研究的下一步工作。

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(編輯:宋亞珍)

Expression and Determination of Activity of the PointMutatedArabidopsisAcetohydroxyacid Synthase

ZHAO Feiyi,JIAO Chengjin,TIAN Chunfang,WANG Taishu,XIE Shangqiang,HE Lijuan

(School of Bioengineering & Biotechnology,Tianshui Normal University,Tianshui,Gansu 741001,China)

Acetohydroxyacid synthase(AHAS) is involved in the synthesis of branched-chain amino acids(BCAAs) inArabidopsis.To investigate the effects of various domains of AHAS on the BCAAs synthesis,the point mutations harboring in the specific sites of the large and small units of AHAS were introduced by site-directed mutagenesis.The mutagened histidine-tagged units of AHAS were expressed individually in the bacterial hosts and the recombinant proteins were purified using Ni beads.The point mutated large and small units were reconstitutedinvitroand the activities of holoenzymes were determined.Moreover,the effects of valine,which is one of the final end products of AHAS,on the activities of the mutated holoenzymes were also examined.The results showed that the G88D mutation in the small unit of AHAS abolished the final end product inhibition and the E305D or E482D mutation in the large unit decreased the activity of AHAS holoenzyme.The two mutations in the large unit displayed difference in the activity of AHAS and the E482D mutation presents the more effects than the E305D on the activity of AHAS.The results in this study suggest that the large unit interacts with the small unit in the AHAS and the various domains in the units of AHAS exhibit distinct functions.

AHAS;point mutation;bacterial expression;holoenzyme activity

1000-4025(2015)04-0662-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0662

2014-12-17;修改稿收到日期:2015-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160060,31260568)

趙菲佚(1972-),男,博士,副教授,主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:tspaulzhao@163.com

Q786;Q789

A