高 飛,姚攀鋒,雒曉鵬,李成磊,吳 琦,姚慧鵬

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院,四川雅安 625014)

苦蕎鋅指蛋白基因FtLSD1的克隆及其對非生物脅迫的應(yīng)答

高 飛,姚攀鋒,雒曉鵬,李成磊,吳 琦,姚慧鵬*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院,四川雅安 625014)

根據(jù)苦蕎(Fagopyrumtataricum)花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別以苦蕎DNA和cDNA為模板,克隆得到1個苦蕎C2C2型鋅指蛋白基因FtLSD1(GenBank登錄號KP252134)的DNA序列和cDNA序列,采用實時熒光定量PCR方法,研究了FtLSD1基因在非生物脅迫下的表達模式。結(jié)果顯示:苦蕎FtLSD1基因DNA全長2 427 bp,由6個外顯子和5個內(nèi)含子構(gòu)成,符合GU-AG剪切原則;cDNA序列包含一個528 bp開放閱讀框,編碼175個氨基酸,具有LSD1家族的典型結(jié)構(gòu)域;UV-B照射和水楊酸處理均能使FtLSD1基因的表達量上升,且UV-B處理在6 h達到最大,為0 h(CK)的3.84倍;水楊酸處理于10 h達到最大,為0 h(CK)的3.44倍,而4 ℃冷脅迫下該基因表達量保持穩(wěn)定。推測該基因可能參與苦蕎抗UV-B和高濃度水楊酸等非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng),為苦蕎的抗逆性研究提供新的視角。

苦蕎;鋅指蛋白LSD1;基因克隆;非生物脅迫

類LSD1基因編碼一類特殊的C2C2型鋅指蛋白,含有3個特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域:CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC,又稱為zf-LSD1結(jié)構(gòu)域[1]。該基因家族克隆的首個基因是擬南芥AtLSD1,隨后在水稻、小麥、玉米等植物中發(fā)現(xiàn)并克隆出更多含有zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的基因[2-3]。功能研究表明,這類LSD1型鋅指蛋白在細胞過敏性死亡、植物廣譜抗病性以及植物對低溫、長日照等非生物環(huán)境脅迫具有調(diào)控功能[4]。Danie等[5]研究表明,擬南芥AtLSD1基因功能是通過應(yīng)答水楊酸(salicylic acid,SA)信號分子,上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)來清除由病原菌或者其它非生物脅迫造成的過量積累的活性氧(reactive oxygen species,ROS),減輕氧迸發(fā)引起的二次傷害。

苦蕎(Fagopyrumtataricum)又稱韃靼蕎麥,屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬一年生草本植物。主要分布在中國西南高寒山地[6]?？嗍w含有豐富的生物類黃酮,對人類多種疾病具有預(yù)防治療作用,被譽為新型的綠色保健食品,備受青睞[7-8]?？嗍w抗逆能力強,能適應(yīng)高寒、高海拔、強紫外及干旱等惡劣環(huán)境。目前,關(guān)于苦蕎抗逆及抗氧化的研究主要集中于黃酮類化合物和SOD酶類對ROS的清除方面。Suzuki等[9]證明苦蕎在受到紫外線、冷和干旱脅迫時葉片中的蘆丁含量以及蘆丁葡萄糖苷酶活性顯著上升,以此來清除脅迫條件下產(chǎn)生的過量ROS。董新純等[10]研究發(fā)現(xiàn),苦蕎經(jīng)UV-B處理后,其SOD總活性提高,說明苦蕎在受到脅迫時,通過提高抗氧化酶活性清除ROS以保護細胞,而其中的分子調(diào)控機制尚不清楚。

本實驗根據(jù)獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用RT-PCR技術(shù)克隆苦蕎抗逆相關(guān)的鋅指蛋白FtLSD1基因序列,并采用UV-B、2 mmol/L水楊酸和4 ℃冷脅迫處理二葉期苦蕎,探究FtLSD1基因的表達與外界非生物脅迫的相關(guān)性,為從分子水平探究苦蕎抗逆和抗氧化的機制提供參考,也為苦蕎的抗逆性研究提供新的視角。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

苦蕎(‘西蕎二號’)種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院實驗室培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件為光照16 h,黑暗8 h,溫度(22±2) ℃,相對濕度60%,培養(yǎng)至二葉期供試備用。

UV-B處理:使用10 W UV-B(308 nm)LED燈照射二葉期苦蕎,光照距離30 cm。水楊酸處理:使用2 mmol/L濃度水楊酸,葉面噴施二葉期苦蕎,以葉面滴水為度,以上處理均于處理前0 h、處理后2、4、6、8、10和12 h分別取供試樣品葉片,液氮冷凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩? ℃冷處理:將二葉期苦蕎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)條件為光照16 h,黑暗8 h,溫度4 ℃,相對濕度60%的光照培養(yǎng)箱,于處理前0 h、處理后12、24、36、48、60和72 h取供試樣品葉片,液氮冷凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1FtLSD1 DNA序列和cDNA序列的克隆 采用改良SDS法[11]提取苦蕎葉片總DNA,采用植物RNAout試劑盒提取各處理樣品的總RNA,并以其為模板使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一條鏈。根據(jù)本實驗室獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計1對特異引物FtLSD1f(5′-TTCTACCATTTTACGCCTCCCTCC-3′)和FtLSD1r(5′-CGACCGGTACGCTGTTGAGTATAAC-3′),分別以苦蕎總DNA和cDNA第一條鏈為模板,PCR擴增FtLSD1 DNA序列和cDNA序列,PCR產(chǎn)物回收純化后連接至pMD19-T 載體,陽性克隆送上海英駿生物公司測序。

1.2.2 序列分析 使用NCBI在線工具Blast進行FtLSD1核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性分析;使用DNAMAN進行多序列比對;利用MEGA 5.0將對比結(jié)果采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 苦蕎FtLSD1基因表達 設(shè)計1對實時定量PCR特異引物FtLSD1 Qf (5′-TGTATCCCTT-TGGAGCACCATCAG-3′)和FtLSD1 Qr(5′-GCCAACCACAACATTGCTGACC-3′),以苦蕎組蛋白H3基因[12]為內(nèi)參基因,引物為H3Qf(GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG)和H3Qr(CCAACAAGGTATGCCTCAGC),采用Takara公司實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time),在BIO-RAD公司的CFX96 Real-Time System進行熒光定量,數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法[13]分析,采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件對水楊酸、UV-B和冷脅迫下苦蕎FtLSD1基因的表達進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎FtLSD1基因DNA序列和cDNA序列的克隆

采用特異引物FtLSD1f和FtLSD1r,以苦蕎DNA為模板,PCR擴增得到4 000 bp左右條帶,測序結(jié)果表明該片段長4 080 bp(圖1,A)。用該特異引物,以苦蕎cDNA為模板,PCR擴增得到900 bp左右條帶(圖1,B),測序結(jié)果表明該片段長877 bp。

2.2 核苷酸序列分析

通過Blast 比對苦蕎FtLSD1 DNA和cDNA序列,確定其全長DNA序列為2 427 bp,由6個外顯子,5個內(nèi)含子構(gòu)成(圖2),符合標準的GU-AG剪切原則。此外,位于ATG上游5 ′-UTR的-2 bp和-1 194 bp之間,存在1個長度為1 391 bp插入片段,同時符合GU-AG剪切原則,屬于特殊的內(nèi)含子結(jié)構(gòu),是比較少見的基因類型[14]。Prediction在線軟件分析結(jié)果表明,在距離起始密碼子-1 140 bp至-1 190 bp存在1個可能的啟動子基礎(chǔ)序列?？嗍wFtLSD1 cDNA序列包含一個528 bp開放閱讀框(ORF)。Blast序列比對顯示,該cDNA序列與豌豆(Pisumsativum)、可可(Theobromacacao)和毛果楊(Populustrichocarpa)的相似性分別為69%、69%和65%。表明克隆得到的序列屬于類LSD1基因家族。

2.3 氨基酸序列及系統(tǒng)進化樹分析

DNAman分析表明,FtLSD1基因編碼175個氨基酸,等電點(pI)為8.37,相對分子質(zhì)量為18.38 KDa,無信號肽。SOPMA預(yù)測表明,該序列由13.14% α-螺旋、24.57%延伸鏈、6.86% β-轉(zhuǎn)角和55.43%無規(guī)則卷曲組成。NCBI Blast結(jié)果表明,苦蕎FtLSD1與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtLSD1、可可(Theobromacacao)TcLSD1和豌豆(Pisumsativum)PsLSD1相似性分別為59%、66%

圖1 苦蕎FtLSD1 DNA(A)和cDNA(B)擴增

圖2 FtLSD1基因結(jié)構(gòu)示意圖ATG表示起始密碼子;TAA表示終止密碼子

和64%。將FtLSD1氨基酸序列與其它物種LSD1氨基酸序列進行對序列比對結(jié)果(圖3)表明,苦蕎FtLSD1與擬南芥等植物的LSD1都具有3個共同的保守肽基序,結(jié)構(gòu)為CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC,是鋅指蛋白的典型的保守序列,而其它區(qū)域相似性較低。

采用MEGA 5.0軟件將LSD1氨基酸序列進行比對,并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖4),發(fā)現(xiàn)苦蕎FtLSD1與擬南芥AtLSD1、甘藍BoLSD1、BoLSD2等共分布于進化樹簇Ⅰ,而擬南芥AtLOL1、水稻OsLSD1和玉米ZmLOL1等分布于進化樹簇Ⅱ。

2.4 苦蕎FtLSD1表達分析

使用熒光定量PCR分析FtLSD1在UV-B、水楊酸和4 ℃冷處理下各個時間段的轉(zhuǎn)錄水平。以苦蕎組蛋白H3為內(nèi)參基因,0 h為對照組,使用2-△△CT法計算FtLSD1基因表達量變化的倍數(shù)關(guān)系。UV-B處理結(jié)果(圖5)表明,FtLSD1基因表達從UV-B處理2 h開始上升,到6 h達到最大,為對照(0 h)的3.84倍,6 h后有所下降,但仍然維持較高表達量。水楊酸處理結(jié)果(圖5)表明,FtLSD1基因的表達量從水楊酸處理的2 h開始上升,4 h有所下降,但在0～10 h表達量保持穩(wěn)定上升趨勢,到10 h達到最大值,為對照(0 h)的3.44倍;12 h后表達量突然下降,僅為對照(0 h)的1.85倍。

圖3 不同植物L(fēng)SD1氨基酸序列比對圖中從上至下依次代表的是苦蕎、甘藍、擬南芥、玉米、水稻、竹子、擬南芥中相應(yīng)的LSD1氨基酸序列;劃線部分為zf-LSD1鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域

圖4 苦蕎LSD1與其他植物L(fēng)SD1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 UV-B和SA處理條件下FtLSD1表達量

圖6 4 ℃冷處理條件下FtLSD1表達量

4 ℃冷處理結(jié)果(圖6)表明,FtLSD1基因的表達量整體趨勢保持穩(wěn)定,12 h開始上升,48 h達到最大值,為對照(0 h)的1.35倍。60 h下降回到冷處理前的水平,然后維持穩(wěn)定。

3 討 論

高通量測序技術(shù)作為新一代的測序技術(shù),目前廣泛應(yīng)用于基因組和轉(zhuǎn)錄組的測序,Lai等[15]根據(jù)獲得的紅薯(Ipomoeabatatas)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆得到紅薯尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶,目前根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得基因序列已經(jīng)成為一種快速高效的克隆方法,與RACE等其它技術(shù)相比,具有簡便、高效、節(jié)省經(jīng)費等特點。本實驗根據(jù)獲得的苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,首次在苦蕎中克隆得到1條鋅指蛋白基因FtLSD1,獲得該基因的DNA和cDNA序列,為從分子水平研究苦蕎抗逆性提供一條靶基因。

Liu等[16]對植物L(fēng)SD1型鋅指蛋白家族進行了分類,含有3個zf-LSD1蛋白、2個zf-LSDl蛋白以及1個zf-LSDl蛋白,同時發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細胞死亡、植物抗病性以及植物對非生物脅迫抗逆性功能的鋅指蛋白多屬于3個zf-LSD1蛋白的亞家族。通過氨基酸序列比對,可知FtLSD1具有3個典型的C2C2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域zf-LSDl,且與十字花科植物擬南芥AtLSD1和甘藍BoLSD1高度同源,而與禾本科植物玉米ZmLOL1、水稻OsLSD1和竹子BohLOL1相比,僅在鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域zf-LSD1(CxxCxRxxLMYxxGAxSVxCxxC)處保守,而在3個zf-LSD1間隔區(qū)域保守性較低,這種結(jié)構(gòu)為該類蛋白調(diào)控功能的多樣化提供了分子依據(jù)。另外,FtLSD1氨基酸序列第一個zf-LSD1結(jié)構(gòu)域的第10個氨基酸Met被同為疏水氨基酸的Leu取代,但不影響其鋅指結(jié)構(gòu)域的形成[17],相關(guān)功能是否存在不同有待進一步研究。由進化樹可知,同一物種的擬南芥AtLSD1和AtLOL1分屬不同的簇,而研究表明AtLSD1和AtLOL1具有相反的功能,AtLSD1參與負調(diào)控ROS介導(dǎo)的信號通路,而AtLOL1參與正調(diào)控,推測苦蕎FtLSD1與AtLSD1具有相似的功能,參與負調(diào)控ROS介導(dǎo)的信號通路,限制植物對外界的應(yīng)激,防止細胞死亡的擴散[18]。

據(jù)報道,SA處理、UV-B處理和冷刺激等非生物脅迫均能打破植物體內(nèi)氧代謝平衡,造成ROS的過量積累,引起細胞的死亡。Kliebenstein等[19]研究表明,擬南芥AtLSD1通過上調(diào)銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)來清除ROS,防止細胞死亡的擴散。本研究發(fā)現(xiàn),苦蕎FtLSD1基因在水楊酸和UV-B處理條件下表達上調(diào),說明FtLSD1可能參與了苦蕎的抗UV-B和水楊酸的防衛(wèi)反應(yīng),其中UV-B處理條件下FtLSD1表達上調(diào)較水楊酸處理迅速,說明該基因?qū)Σ煌耐饨绱碳ぞ哂胁煌捻憫?yīng)速度。而4 ℃冷處理條件下,FtLSD1基因表達量相對穩(wěn)定。Huang等[20]研究表明,4 ℃冷處理條件下擬南芥AtLSD1表達量在72 h內(nèi)表達量維持穩(wěn)定,而在72 h后開始積累,暗示在冷脅迫的初期階段,植物可能存在其它的途徑來抵抗冷刺激。

苦蕎主要分布在中國西南山區(qū),該地區(qū)干旱、晝夜溫差大、紫外線強,而苦蕎具有良好的適應(yīng)性,表現(xiàn)出良好的抗逆性能。已有的研究主要集中在苦蕎如何通過提高黃酮類物質(zhì)合成來參與抗逆過程,而本實驗則首次對苦蕎抗逆相關(guān)的鋅指蛋白基因FtLSD1進行研究,分析其在UV-B、水楊酸和冷處理等非生物學(xué)脅迫下的響應(yīng),為研究苦蕎的抗逆機制提供新的思路。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Zinc Finger Protein GeneFtLSD1 inFagopyrumtataricumunder Abiotic Stress

GAO Fei,YAO Panfeng,LUO Xiaopeng,LI Chenglei,WU Qi,YAO Huipeng*

(College of Life Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an,Sichuan 625014,China)

According to transcriptome data ofFagopyrumtataricumat flowering,using PCR and RT-PCR techniques,the DNA and full-length cDNA sequences ofFtLSD1 gene (GenBank accession number:KP252134) were amplified fromF.tataricum.The obtained sequences were analyzed by bioinformatics software,and the expressionFtLSD1 gene were analysed by qPCR under UV-B,SA and 4 ℃ cold stress.The results showed that the DNA sequence ofFtLSD1 gene was 2 427 bp,of which consisted 6 exons and 5 introns,in line with the principle of GU-AG splicing,and the cDNA ofFtLSD1 contained a 528 bp ORF.The UV-B radiation and 2 mmol/L salicylic acid could lead to a significant increase in the expression of theFtLSD1 gene,while 4 ℃ cold stress remained stable expression levels of the gene.The results expected to lay a foundation for study the stress resistance inF.tataricum.

Fagopyrumtataricum;zinc finger protein LSD1;gene cloning;abiotic stress

1000-4025(2015)04-0669-05

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0669

2014-12-12;修改稿收到日期:2015-02-09

四川省教育廳青年基金(13ZB0294)

高 飛(1991-),男,在讀碩士研究生,主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:gaofeibiology@aliyun.com

*通信作者:姚慧鵬,博士,副教授,主要從事植物分子生物學(xué)研究。 E-mail:yaohuipeng0921@163.com

Q785;Q789

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