李安峰，駱堅(jiān)平，黃 丹，潘 濤

(北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院國(guó)家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

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傳統(tǒng)活性污泥法和膜生物反應(yīng)器馴化期微生物群落組成特征

李安峰，駱堅(jiān)平，黃 丹，潘 濤

(北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院國(guó)家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

[目的]比較傳統(tǒng)活性污泥法(S1)和膜生物反應(yīng)器(MBR,S2)工藝微生物群落之間的差異。[方法]通過MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，分析處于馴化期的S1和S2工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)組成。[結(jié)果]從S1和S2分別獲得47 354和51 882條有效序列，平均長(zhǎng)度為253 bp。在97%相似性水平下，從S1和S2分別可確定2 693和3 208個(gè)操作分類單元(OTU)，其中有1 156個(gè)OTU為相同單元。S1和S2的豐度指數(shù)(Chao 1)分別為6 639.3和9 564.1，Shannon指數(shù)為9.03和9.13。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，兩種處理系統(tǒng)中活性污泥的優(yōu)勢(shì)菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)；同時(shí)，硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在MBR中更易富集，所占比例要高于傳統(tǒng)活性污泥法。[結(jié)論]在馴化期中，MBR和傳統(tǒng)活性污泥法均具有較高的微生物多樣性以及相似的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)。由于對(duì)微生物的高效過濾作用，馴化期MBR中微生物群落多樣性更為豐富。

傳統(tǒng)活性污泥法；膜生物反應(yīng)器；高通量；微生物群落

污水處理系統(tǒng)中，馴化期是微生物群落對(duì)環(huán)境因子和操作條件處于逐漸適應(yīng)的階段，與穩(wěn)定運(yùn)行期相比，微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異[1-2]。因而，了解處于馴化期污水處理系統(tǒng)的微生物組成對(duì)于工藝的設(shè)計(jì)、調(diào)試和穩(wěn)定運(yùn)行具有指導(dǎo)意義。然而，污水處理系統(tǒng)中微生物群落是極其復(fù)雜的。由于能夠被純培養(yǎng)的微生物在環(huán)境中的比例只有0.1%～10.0%，因此采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析局限性較大，無(wú)法獲取足夠的微生物信息[3]。20世紀(jì)90年代以來(lái)，以核酸技術(shù)為主要內(nèi)容的分子生物學(xué)技術(shù)，例如原位熒光雜交法(FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(PCR-DGGE/TGGE)、末端標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、16S rRNA克隆文庫(kù)構(gòu)建、實(shí)時(shí)PCR等，極大地克服了微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足，可以在分子水平評(píng)價(jià)群落多樣性，揭示生物與環(huán)境之間的作用機(jī)制等[4-5]。Rosenkran等通過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)水苯酚濃度從120 mg/L增加到800 mg/L時(shí)，厭氧序批式反應(yīng)器中微生物群落結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化，但是當(dāng)苯酚進(jìn)水濃度從800 mg/L上升到1 200 mg/L時(shí)，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了急劇變化，其中優(yōu)勢(shì)菌由Spirochaetaceae、Anaerolineaceae變?yōu)锳naerolineaceae[6]。通過T-RFLP對(duì)A/O-MBR系統(tǒng)微生物群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同膜污染時(shí)期，好氧池中微生物結(jié)構(gòu)也隨著變化，在膜污染初期，好氧池中微生物以Thiothrixsp.為主；當(dāng)膜污染加劇時(shí)，Zoogloearamigera則取代Thiothrixsp.成為優(yōu)勢(shì)菌種[7]。DGGE結(jié)果表明，利用不同接種污泥而相同厭氧工藝處理奶酪廠生產(chǎn)廢水時(shí)，污泥微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高度一致性[8]。但是，這些技術(shù)由于存在操作引起的誤差大、步驟繁雜等問題，為其應(yīng)用帶來(lái)了許多限制[9-10]。

近年來(lái)，作為第二代測(cè)序技術(shù)的高通量測(cè)序得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用，如454焦磷酸高通量測(cè)序、MiSeq高通量測(cè)序等。高通量測(cè)序技術(shù)一次可以對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序，可以對(duì)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全貌分析[11-12]。Hu等采用454焦磷酸高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同MBR污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，有些污水廠活性污泥中Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌種，而有些污水廠活性污泥中則以Bacteroidetes為主，并且通過S?rensen相似性指數(shù)及主成分分析發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)總體相似性不是很高[13]。筆者通過MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)馴化期MBR以及傳統(tǒng)活性污泥法工藝的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為工藝的調(diào)試和優(yōu)化提供微生物學(xué)方面的信息。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置該試驗(yàn)采用好氧平板式MBR以及傳統(tǒng)活性污泥法處理小區(qū)生活污水。反應(yīng)器有效容積均為120 L，試驗(yàn)過程中溶解氧均控制在2 mg/L左右。MBR和傳統(tǒng)活性污泥法均處于馴化期，馴化時(shí)間2個(gè)月。其中，MBR膜組件有效膜面積為1 m2，材質(zhì)為聚偏氟乙烯(PVDF)，孔徑<0.1 μm，購(gòu)自上海斯納普公司。MBR抽停比為6∶2，污泥濃度為4 g/L，HRT為8 h。傳統(tǒng)活性污泥反應(yīng)器MLSS為1.5 g/L左右，HRT=8 h。小區(qū)生活污水進(jìn)水COD、TN分別在200～800，50～120 mg/L之間波動(dòng)，該試驗(yàn)接種污泥均取自某污水處理廠二沉池所排出的剩余污泥。

1.2 主要試劑及儀器Omega土壤DNA小量提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)；Nanodrop ND-1000全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；CFX 96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)BIORAD公司)；離心柱型超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Illumina MiSeq測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)；引物合成、MiSeq高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 微生物多樣性分析

1.3.1DNA提取與PCR擴(kuò)增。分別提取傳統(tǒng)活性污泥反應(yīng)器(S1)和MBR(S2)中的污泥混合液。首先利用Omega土壤DNA小量提取試劑盒提取兩組樣品的DNA，DNA的濃度與純度利用分光光度法檢驗(yàn)。其中，DNA濃度通過測(cè)定其在260 nm下吸光度確定；DNA純度通過比較260 nm/230 nm(DNA/腐殖酸)和260 nm/280 nm(DNA/蛋白質(zhì))的值確定。PCR擴(kuò)增區(qū)域選擇樣本16S rRNA的V4區(qū)域，16S rRNA引物序列為515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應(yīng)體系以1 μl DNA為模板，擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；35個(gè)循環(huán)之后，72 ℃延伸5 min。利用超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用2%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2MiSeq高通量測(cè)序。使用Illumina的MiSeq測(cè)序儀，對(duì)16S rRNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙端測(cè)序。使用QIIME軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。通過flash軟件將有overlap的一對(duì)reads進(jìn)行拼接。

1.3.3生物信息學(xué)分析。根據(jù)序列的相似性，在97%相似水平下，利用uparse軟件將序列歸為多個(gè)OTU(操作分類單元)。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)，做出每個(gè)樣品的稀釋曲線，同時(shí)計(jì)算各個(gè)樣品的相關(guān)分析指數(shù)，包括豐度指數(shù)(Chao 1)、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))。另外，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分、OTU分布Venn圖、Rank-Abundance曲線以及門水平的樣品群落結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列數(shù)目通過對(duì)活性污泥樣品16S rRNA基因文庫(kù)MiSeq測(cè)序，從傳統(tǒng)活性污泥法污泥混合液樣品(S1)和MBR污泥混合液樣品(S2)各獲得47 354和51 882條有效序列，序列平均長(zhǎng)度為253 bp。將序列與Silva庫(kù)進(jìn)行比對(duì)聚類分析，在97%相似水平下，從S1和S2中分別得到的OTU數(shù)目為2 693和3 208，并共有1 156個(gè)OTU(圖1)。這表明在馴化期中傳統(tǒng)活性污泥法和MBR均具有較高的微生物多樣性，而且MBR中的多樣性可能更豐富。

2.2 主成分分析從圖2可知，與污泥混合液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的有關(guān)主成分中，P1主成分的方差貢獻(xiàn)率為15.45%，P2主成分的方差貢獻(xiàn)率為11.97%。S1和S2所代表的點(diǎn)距離相近，這表明S1和S2所代表的菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異，但不是很大，這與上述兩個(gè)系統(tǒng)中OTU的分布相吻合。

2.3 Rank-Abundance曲線圖3為S1和S2樣品的Rank-Abundance(相對(duì)豐度)曲線。Rank-Abundance曲線用于同時(shí)解釋樣品多樣性的兩個(gè)方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長(zhǎng)度，即OTU數(shù)來(lái)反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富，結(jié)果與OTU分布Venn圖分析一致。物種組成的均勻程度由曲線的形狀來(lái)反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。對(duì)比S1和S2的曲線可知，S1和S2的曲線的形狀均不太平坦，這意味著S1和S2中微生物群落物種的分布均勻程度不高。

2.4 微生物群落多樣性分析為了研究污泥混合液中微生物群落多樣性，選取群落豐度指數(shù)(Chao 1指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))為參考標(biāo)準(zhǔn)。在97%和95%的相似水平下，S1的Chao 1指數(shù)為6 639.3/2 904.5，Shannon指數(shù)為9.03/8.23;S2的Chao 1指數(shù)為8 564.1/3 819.5，Shannon指數(shù)為9.13/8.27。馴化期中MBR污泥混合液的群落多樣性高于傳統(tǒng)污泥法污泥混合液樣品，而且MBR和傳統(tǒng)活性污泥法反應(yīng)器中Shannon指數(shù)(97%)均高于之前報(bào)道[13-15]。一般認(rèn)為，處于穩(wěn)定運(yùn)行期的MBR的SRT較長(zhǎng)，F(xiàn)/M較低，污泥濃度較高，這些條件更利于適應(yīng)性強(qiáng)的菌落富集，因而MBR中微生物群落多樣性(Simpon指數(shù))要低于普通A/A/O、A/O工藝[13]。但在該研究中，由于污水處理系統(tǒng)均處于馴化期，反應(yīng)器中微生物還處于增長(zhǎng)階段，MLSS仍具有較大的上升空間，此時(shí)不同的微生物正在對(duì)系統(tǒng)條件進(jìn)行適應(yīng)性變化，會(huì)表現(xiàn)出較高的多樣性[16]。同時(shí)，MBR的高效過濾作用使得這種多樣性在這一時(shí)期可以得到更多的保留。當(dāng)然，當(dāng)環(huán)境因素和操作條件對(duì)微生物的定向選擇完成后，系統(tǒng)進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)組成穩(wěn)定，種群數(shù)量較接種時(shí)期大為減少[17-18]。

2.5 樣品群落結(jié)構(gòu)分析從門分類水平的群落分析表明(圖4)，S1和S2均由11個(gè)門以及其他未知的菌類組成，其中變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)共占85%以上，其余部分如放線菌(Actinobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、螺旋體門(Spirochaetes)、熱袍菌門(Thermotogae)以及其他一些未知菌種僅占15%左右。在S1和S2中，變形菌門所占比例最大，主要功能為去除水中有機(jī)物[19]，其次為擬桿菌門、浮霉菌門。優(yōu)勢(shì)菌與之前的研究結(jié)果基本一致，不過次優(yōu)勢(shì)菌略有差異[20-21]。從門分類水平而言，傳統(tǒng)活性污泥法工藝和MBR工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)相似，無(wú)顯著性差異。之前也有類似的報(bào)道，同一廢水處理系統(tǒng)不同運(yùn)行工藝(A2O和倒置A2O、MBR和傳統(tǒng)活性污泥法)的微生物群落結(jié)構(gòu)有高度的相似性，這可能跟相同的進(jìn)水水質(zhì)有很大的關(guān)系[22-23]。另外，S2中未知菌類所占比例更高，這與S2中生物多樣性更豐富的結(jié)論是一致的。

眾所周知，由于MBR工藝可以實(shí)現(xiàn)水力停留時(shí)間和污泥齡的完全分離，MBR工藝更有利于世代周期長(zhǎng)的硝化菌的截留與生長(zhǎng)。該研究中，通過對(duì)比也發(fā)現(xiàn)了該類現(xiàn)象，S2中硝化螺旋菌門比例要高于S1。

3 總結(jié)

處于馴化期的MBR和傳統(tǒng)活性污泥處理系統(tǒng)中均具有較高的微生物多樣性，而且由于MBR的高效過濾作用，其微生物群落多樣性更為豐富。在門分類水平上，兩種處理系統(tǒng)中活性污泥具有相似的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢(shì)菌群均為變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌門；同時(shí)，硝化螺旋菌門在MBR中更易富集，所占比例要高于傳統(tǒng)活性污泥法。

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Microbial Community Characteristics of Traditional Activated Sludge Process and MBR in Acclimation Period

LI An-feng, LUO Jian-ping, HUANG Dan et al

(National Engineering Research Center for Urban Environmental Pollution Control, Beijing Municipal Research Institute of Environmental Protection, Beijing 100037)

[Objective] To compare the microbial community characteristics in a traditional activated sludge process (S1) and membrane bio-reactor (MBR, S2). [Method] MiSeq high-throughput sequencing was used to investigate the microbial community characteristics in S1 and S2. [Result] The results showed that 47 354 and 51 882 reads with an average read length of 253 bp were found from S1 and S2, respectively. At the similarity level of 97%, 2 693 and 3 208 operational taxonomic units (OTUs) were obtained from S1 and S2, respectively, and number of common OTUs was 1 156. The richness index (Chao 1) of S1 and S2 were 6 639.3 and 9 564.1, and Shannon index were 9.03 and 9.13, respectively. In addition, Analysis of system evolution demonstrated that Proteobacteria, Planctomycetes and Bacteroidetes were the dominant phylum in both S1 and S2. Morever, the nitrifying bacteria could be enriched more effectively in MBR, and the ratio of Nitrospirae was higher in comparison with that in the traditional activated sludge process. [Conclusion] In acclimation period, both traditional activated sludge process and MBR had very high microbial community diversity, and similar microbial community structure at phylum level. Higher diversity could be found from MBR in acclimation period due to its efficient filtration.

Traditional activated sludge process; MBR; High-throughput sequencing; Microbial community

北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院科技基金項(xiàng)目(2013A07)。

李安峰(1974-)，男，山東泰安人，副研究員，博士，從事水污染控制研究。

2014-11-21

S 181.3

A

0517-6611(2015)01-189-03