田志革， 柴洪亮， 華育平

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

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禽6型副粘病毒V蛋白對抗宿主細胞干擾素β的產(chǎn)生

田志革， 柴洪亮， 華育平*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的] 研究禽6型副粘病毒V蛋白對抗宿主細胞干擾素β的產(chǎn)生的機制。[方法] 構(gòu)建真核表達禽6型副粘病毒P、V、W蛋白的重組載體，分別與IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，接種仙臺病毒刺激細胞后，測定細胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶活性。[結(jié)果]禽6型副粘病毒V蛋白能通過降低NF-κB的活性，進而顯著抑制宿主細胞產(chǎn)生IFN-β。[結(jié)論]該研究初步闡明了禽6型副粘病毒V蛋白對抗宿主天然免疫的機制。

副粘病毒；V蛋白；對抗；干擾素β

當(dāng)病毒侵染宿主時，會遭受多種來自宿主的抗病毒反應(yīng)，其中干擾素(IFN)反應(yīng)在早期的天然免疫及調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)時發(fā)揮重要的作用[1-3]。大量研究表明，大部分副粘病毒編碼特殊的附件蛋白，即由P基因編輯剪接產(chǎn)生的V或/和C蛋白，通過阻斷IFN傳導(dǎo)信號或限制宿主IFN的產(chǎn)生來規(guī)避IFN系統(tǒng)[4-9]。例如，副粘病毒科的腮腺炎病毒屬成員5型猿猴病毒(SV5)通過降解STAT1來阻斷IFN的信號傳導(dǎo)，仙臺病毒(SeV)的C蛋白發(fā)揮相似的功能。SV5及SeV的V蛋白能降低干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-3和NF-κB的活性，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生[10-11]。

副粘病毒P基因除了表達P蛋白外，還通過編輯剪接表達V蛋白及W蛋白。為了闡明禽6型副粘病毒對抗宿主細胞先天免疫的機制，筆者將表達P、V和W蛋白的重組質(zhì)粒與一系列報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，通過測定熒光素酶活性來判斷病毒蛋白對IFN-β基因的啟動子序列的作用機制，從而對抗宿主細胞先天免疫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與細胞。重組質(zhì)粒pCDNA-P(flag標(biāo)簽)、pCDNA-V(flag標(biāo)簽)、pCDNA-W(flag標(biāo)簽)由筆者構(gòu)建；IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc、AP-1-luc雙熒光素酶報告質(zhì)粒均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡曉亮博士惠贈；HEK-293T細胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室馬病團隊提供。

1.1.2主要試劑。Flag鼠源單抗和脂質(zhì)體Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；DyLight800標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自KPL公司；雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)試劑盒購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1轉(zhuǎn)染試驗。將HEK-293T細胞均勻鋪于24孔板中，待細胞長成單層且密度達到80%左右時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系中的共同成分為：300 μl DMEM、3 μl脂質(zhì)體、60 ng RL-TK質(zhì)粒；另依據(jù)試驗?zāi)康牟煌?，分別向體系中加入0.6 μg IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/I-Luc或AP-1-luc報告質(zhì)粒，每個試驗重復(fù)3次，同時設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的空白對照。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入100 HAU的SeV進行刺激，同時設(shè)置不加病毒刺激的空白對照。病毒刺激12 h后，棄去細胞培養(yǎng)液，用細胞裂解液裂解細胞，離心后棄去細胞碎片，裂解獲得的上清液用于免疫印跡分析及熒光素酶活性測定試驗。

1.2.2免疫印跡分析。裂解上清液與5×Loading buffer按照4∶1的比例混合，在沸水浴中煮10 min，樣品進行蛋白電泳后，轉(zhuǎn)印至纖維素膜，進行常規(guī)免疫印跡分析。其中，一抗使用flag鼠源單抗，二抗使用羊抗鼠IgG抗體,β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.2.3熒光素酶活性的測定。取裂解上清液20 μl，使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)試劑盒測定其活性。

2 結(jié)果與分析

為了驗證表達的蛋白能否抑制IFN-β啟動子的活性，在不同蛋白表達的情況下測定IFN-β-luc報告基因的雙熒光素酶活性水平，當(dāng)SeV感染293T細胞時，IFN-β-luc的酶活性是未染毒空白對照的50倍左右，在表達蛋白P及W蛋白時酶活性并未被抑制；在V蛋白表達后，酶活性被顯著抑制(圖1)，表明APMV6的V蛋白能夠抑制IFN-β啟動子的活性。為了闡明V蛋白發(fā)揮作用的區(qū)域，將表達V蛋白的質(zhì)粒與NF-κB-luc、PRDⅢ/I-luc、AP-1-luc的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，在SeV刺激條件下測定雙熒光素酶活性。結(jié)果表明，V蛋白能顯著抑制NF-κB啟動子活性(圖2)，對PRDⅢ/I(圖3)和AP-1(圖4)啟動子也有抑制作用，但不如對NF-κB啟動子的抑制效果明顯。免疫印跡分析(Western blot)試驗表明，重組蛋白能夠在293T細胞中表達，β-actin作為內(nèi)參蛋白，表明細胞數(shù)目之間并無差異(圖1～4)。

3 討論

目前，病毒對抗宿主先天免疫的機制研究已成為熱點，具有對抗功能的蛋白及對抗機制被不斷發(fā)現(xiàn)。關(guān)于禽6型副粘病毒分離的報道并不多見，更沒有關(guān)于該病毒對抗宿主先天免疫的研究，作為副粘病毒的一種，其對抗機制與其他已報道的副粘病毒是否相似尚存在差異，值得探討。筆者利用自主分離的1株APMV6，表達其P、V、W蛋白，用于對抗機制的研究。筆者首先發(fā)現(xiàn)V蛋白能夠抑制IFN-β啟動子的活性，但并不清楚V蛋白作用于該啟動子NF-κΒ、PRDⅢ/I、AP-1中的哪個部分。筆者進行了進一步驗證試驗，發(fā)現(xiàn)V蛋白對這3個部分都具有抑制作用，但對NF-κΒ啟動子的活性顯著抑制。

[1] GOODBOURN S,DIDCOCK L,RANDALL R E.Interferons:cell signaling immune modulation,antiviral responses and virus countermeasures [J].J Gen Virol,2000,81:2341-2364.

[2] SEN G C.Viruses and interferons[J].Annu Rev Microbiol,2001,55:255-281.

[3] TANIGUCHI T,TAKAOKA A.The interferon-α/β system in antiviral responses:a multimodal machinery of gene regulation by the IRF family of transcription factors [J].Curr Opin Immunol,2002,14:111-116.

[4] GARCIA-SASTRE A.Inhibition of interferon-mediated antiviral responses by influenza A virus and other negative-strand RNA viruses [J].Virology,2001,279:375-384.

[5] GARCIA-SASTRE A.Identification and characterization of viral antagonists of type I interferon in negative-strand RNA virus [J].Curr Top Microbiol Immunol,2004,283:249-280.

[6] GOTOH B,KOMATSU T,TAKEUCHI K,et al.Paramyxovirus accessory proteins as interferon antagonists [J].Microbiol Immunol,2001,45:787-800.

[7] GOTOH B,KOMATSU T,TAKEUCHI K,et al.Paramyxovirus strategies for evading the interferon response [J].Rev Med Virol,2002,12:337-357.

[8] HORVATH C M.Weapons of STAT destruction.Interferon evasion by paramyxovirus V protein [J].Eur J Biochem,2004,271:4621-4628.

[9] NAGAI Y,KATO A.Accessory genes of the paramyxoviridae,a large family of nonsegmented negative strand RNA viruses,as a focus of active investigation by reverse genetic [J].Curr Top Microbiol Immunol,2004,283:198-248.

[10] DIDCOCK L,YOUNG D F,GOODBOURN S,et al.Sendai virus and simian virus 5 block activation of interferon-responsive gene:importance for virus pathogenesis [J].J Virol,1999,73:3125-3133.

[11] DIDCOCK L,YOUNG D F,GOODBOURN S,et al.The V protein of simian virus 5 inhibits interferon signaling by targeting STAT1 for proteasome-mediated degradation [J].J Virol,1999,73:9928-9933.

The V Protein of Avian Paramyxovirus Type 6 Antagonizes Beta Interferon Production of Host Cells

TIAN Zhi-ge, CHAI Hong-liang, HUA Yu-ping*

(Department of Wildlife Resource, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To study the mechanism of avian paramyxovirus type 6 V protein antagonizing beta interferon production. [Method] The study constructed the combine plasmids pCDNA-P, pCDNA-V, pCDNA-W for expressing protein P, V, W, respectively. The 293T cells were cotransfected with combine plasmids and report gene plasmids, after SeV stimulating, the firely luciferase and Renilla luciferase activities were determined. [Result] The V protein remarkably inhibited beta interferon production by decreasing the NF-κB activity. [Conclusion] The study clarified the mechanism of V protein antagonizing innate immunity of host cells preliminarily.

Prarmyxovirus; V protein; Antagonize; Beta interferon

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(2572014AA03)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201404404)。

田志革(1985- )，女，黑龍江大慶人，博士研究生，研究方向：動物病毒學(xué)及分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事野鳥疾病監(jiān)測與防治研究。

2014-11-24

S 852.65+7

A

0517-6611(2015)01-130-02