翟科峰，段 紅，曹穩(wěn)根，聶 蘭

1.宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所，安徽宿州，234000;

2.宿州學(xué)院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，安徽宿州，234000

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HPLC法測定王棗子中齊墩果酸的含量

翟科峰，段 紅，曹穩(wěn)根，聶 蘭

1.宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所，安徽宿州，234000;

2.宿州學(xué)院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，安徽宿州，234000

建立高效液相色譜法測定王棗子中齊墩果酸的含量。采用Shim-pack vp-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長：210 nm，流動相：甲醇-水(90∶10)，流速：0.8 mL·min-1。結(jié)果表明：齊墩果酸在1.0～10.0 μg·mL-1(r=0.9998，n=5)范圍內(nèi)濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，且平均回收率為99.2%，RSD=1.9%。所建方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便，穩(wěn)定性好。

王棗子；齊墩果酸；HPLC；含量測定

王棗子(Rabdosiaamethystoides(Benth) Hara)系唇形科香茶菜屬植物，廣泛分布于江蘇、安徽、浙江、河南、湖北、廣西等省，民間用于治療急性傳染性肝炎，具有抗菌、消炎和抗腫瘤等作用[1]，其化學(xué)成分主要有王棗子甲素、乙素和丙素，毛葉醇、齊墩果酸和卜谷街醇[2]。其中，齊墩果酸(Oleanolic acid，簡稱 OA)，又名慶四素，是五環(huán)三萜類化合物，它以游離或結(jié)合成苷的形式存在，可從許多中草藥中提取分離得到。OA是一種天然來源的藥物，除具有保肝、護(hù)胃、強(qiáng)心、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗高血壓等生物活性外，還具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集和抗過氧化等多種藥理作用，且毒副作用小，安全性高，有廣闊的臨床應(yīng)用前景[3]。王棗子中齊墩果酸含量的高低在一定程度上能反映藥材的質(zhì)量，然而至今還未有報道以齊墩果酸作為王棗子的質(zhì)量控制指標(biāo)。目前，齊墩果酸的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)和氣相色譜法(GC)等方法[3-9]。本文采用高效液相色譜法測定王棗子中齊墩果酸的含量。

CNM算法適用：CNM算法適用于加權(quán)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)規(guī)模為百萬級，且對準(zhǔn)確度要求不是非常嚴(yán)格的復(fù)雜系統(tǒng)。CNM算法的發(fā)明人之一Clauset已成功地將該算法用于亞馬遜網(wǎng)上書店的網(wǎng)頁鏈接所形成的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中。這個網(wǎng)絡(luò)規(guī)模十分龐大，大約包含40萬個節(jié)點(diǎn)和大約200多萬條邊[9]。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

王棗子(宿州市康源藥業(yè)有限公司，批號：20110102，批號：20110304，批號：20110606)，齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號：110709-200505)。甲醇為色譜純，水為超純水，無水乙醇和三氯甲烷為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(CTO-10ASVP，日本島津公司)，紫外檢測器(SPD-20A，日本島津公司)，色譜工作站(LC solution-Lite，日本島津公司)，超純水儀(Master-D UVF，臺灣精達(dá)電子儀器有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山禾創(chuàng)公司)，電子天平(FA2004N，梅特勒-托利多國際股份有限公司)，精密酸度計(jì)(PHS-3CT，上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52，上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，電子恒溫水浴鍋(DZKW-C，滄州新三思試驗(yàn)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Shim-pack vp-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇-水(90∶10)；檢測波長：210 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的齊墩果酸對照品5.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成濃度為0.50 mg·mL-1的溶液，過0.45 μm濾膜，即為對照品貯備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取王棗子藥材粉末1 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加90 %乙醇25 mL，稱重，60℃超聲提取60 min，冷卻，稱重，用乙醇補(bǔ)足失去部分，過濾，取續(xù)濾液10 mL，用鹽酸調(diào)pH=1，加熱回流30 min，水解液加水10 mL，用三氯甲烷萃取(10 mL×3)，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。進(jìn)樣，測試結(jié)果見圖1。

圖1 齊墩果酸的液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品貯備液1 mL于50 mL量瓶中，甲醇定容，再從此溶液中精密吸取2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中(用甲醇定容)，制成濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg·mL-1的溶液，各精密進(jìn)樣20 μL。以對照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 21084X-4879.6(r=0.9998，n=5)，表明齊墩果酸在1.0～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度考察

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.65%。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品5份，分別依“2.2.2”條件制備供試品溶液。分別測定峰面積(n=5)，計(jì)算得到RSD值為0.95%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品，制成供試品溶液。在室溫下保存，分別在0，2，4，6，8小時測定其峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.80%。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取齊墩果酸對照品適量，加入已知含量的樣品(約為測定方法中樣品的半量)中，按“2.1”條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，本法回收率較好，方法可行。

表1 齊墩果酸回收率

2.4 提取條件考察

2.4.1 提取溫度考察

在3個100 mL錐形瓶中，分別精確加入1 g樣品，再各加入90%乙醇25 mL，分別在40℃、60℃、80℃溫度下超聲處理，按“2.2.2”條件制備供試品進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。表2顯示，最佳提取溫度為60℃。

表2 超聲溫度的考察

2.4.2 提取時間考察

在3個100 mL錐形瓶中，分別精確加入1 g樣品，再各加入90%乙醇25 mL，分別超聲處理40、60、80 min，按“2.2.2”條件制備供試品進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。表3顯示，最佳提取時間為60 min。

表3 超聲時間的考察

2.4.3 提取酸度考察

在3個100 mL錐形瓶中，分別精確加入1 g樣品，再各加入90%乙醇25 mL，分別在pH=1、3、5的條件下，按“2.2.2”條件制備供試品進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。表4顯示，最佳提取酸度為pH=1。

表4 水解酸度的考察

2.5 三批藥材的測定

按照上述優(yōu)化條件，制備三批藥材，分別精密吸取樣品溶液20 μL，進(jìn)樣、測定峰面積后計(jì)算其平均含量，結(jié)果如表5。

表5 不同批號藥材中齊墩果酸含量

3 結(jié) 論

運(yùn)用高效液相色譜法測定王棗子中齊墩果酸的含量，色譜條件為：流動相甲醇-水(90∶10)；檢測波長：210 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃為最佳色譜條件。60 ℃下超聲1 h，pH=1下水解30 min為最佳提取條件。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到回收率為99.2%，說明該方法穩(wěn)定可行。王棗子中齊墩果酸的含量大約為220～230 μg·g-1。

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[2]王先榮,王紅萍,李有文,等.王棗子化學(xué)成分的研究[J].中草藥,1994,25(6):285

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(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.06.025

2015-01-18

宿州學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所平臺項(xiàng)目“王棗子總萜部位制備及其抗免疫肝損傷作用的研究”(2014YKF32)；宿州學(xué)院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心開放課題“何首烏多倍體選育”(2013YKF11)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“基于‘網(wǎng)絡(luò)預(yù)測—實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證’模式探討風(fēng)濕定新組方防治風(fēng)濕病作用機(jī)制研究”(201410379017)。

翟科峰(1981-)，安徽無為人，在讀博士研究生，講師，主要方向：中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。

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A

1673-2006(2015)06-0093-03