羅 春徐 靈何 靜史建伍盛軍慶彭 扣王軍花黃 濱洪一江

(1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031; 2. 江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 南昌 330046)

池蝶蚌CyPA的應(yīng)激表達(dá)及對Hela細(xì)胞生長的影響

羅 春1徐 靈1何 靜1史建伍1盛軍慶1彭 扣1王軍花1黃 濱2洪一江1

(1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院, 南昌 330031; 2. 江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 南昌 330046)

研究分析了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)親環(huán)蛋白A(Cyclophilin A, CyPA)誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)和對Hela細(xì)胞生長的影響。采用嗜水氣單胞桿菌誘導(dǎo)刺激池蝶蚌, 并利用Real-time PCR技術(shù)對其肝臟、性腺和血淋巴中CyPA基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析, 應(yīng)激實(shí)驗(yàn)表明, 在嗜水氣單胞桿菌刺激后血淋巴、肝臟和性腺中的CyPA在誘導(dǎo) 4h出現(xiàn)一個表達(dá)峰, 8h后開始下降, 說明池蝶蚌 HsCyPA基因參與免疫防御應(yīng)答反應(yīng); 利用pET-32a(+)表達(dá)載體, 根據(jù)HsCyPA基因cDNA的序列, 構(gòu)建了含有完整開放閱讀框(ORF)的表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá), 優(yōu)化誘導(dǎo)條件后, 通過親和層析獲得了含量較高的上清可溶性蛋白; 采用MTT法, 將原核表達(dá)的重組CyPA蛋白稀釋到相應(yīng)(50、100、200、400和800 ng/mL)濃度, 刺激Hela細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn), 重組池蝶蚌 CyPA蛋白能促進(jìn) Hela細(xì)胞生長, 刺激濃度為 100 ng/mL時, 達(dá)到最大增殖率18.5%。結(jié)果初步表明, 池蝶蚌 CyPA是一個既參與免疫應(yīng)激又對細(xì)胞的生長發(fā)育具有影響的功能廣泛的蛋白質(zhì)。

池蝶蚌; 親環(huán)蛋白A; Real-time PCR; 原核表達(dá); Hela細(xì)胞; MTT法

親環(huán)素家族(Cyclophiins, Cyps)是一類廣泛分布于自然界、具有高度保守性的多功能蛋白家族, 它們是免疫抑制劑環(huán)孢素A(Cyclophilins, CsA)細(xì)胞內(nèi)受體又稱為CsA結(jié)合蛋白[1]。當(dāng)前, 對CyPA主要集中于其在不同生物體內(nèi)的分布、相關(guān)蛋白序列的分析、結(jié)構(gòu)及其重要的生物學(xué)功能等領(lǐng)域的研究[2]。諸多研究結(jié)果顯示CyPA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Qian等[3]通過RNA干擾技術(shù)抑制CyPA在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的表達(dá), 通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)CypA表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖明顯下降。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的方法發(fā)現(xiàn), CyPA在食管鱗癌[4]、男性乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、頭頸部腫瘤[7]和舌鱗狀細(xì)胞癌[8]等腫瘤中的表達(dá)也明顯上調(diào), 參與其惡性的生物學(xué)行為。相關(guān)研究報(bào)道, CypA的分子伴侶功能對在形成腫瘤中不當(dāng)?shù)男盘柤せ钤斐傻臈l件復(fù)合物的錯誤折疊和斷裂的修復(fù)起著很重要的作用, 并且維持蛋白的穩(wěn)態(tài), 這很可能是腫瘤生存的關(guān)鍵[9]。此外, CyPA基因可作為一個免疫抑制劑參與病毒復(fù)制的中間過程,參與機(jī)體的免疫機(jī)制[12]; 研究還發(fā)現(xiàn), 哺乳動物中的CyPA基因?qū)Φ钟《靖腥酒鹬匾慕巧玔13], 表明CyPA基因參與先天免疫機(jī)制。近年來研究發(fā)現(xiàn), CyPA在櫛孔扇貝以及斑節(jié)對蝦等水生生物中可能充當(dāng)一種免疫應(yīng)激的角色[10,11]。

池蝶蚌屬軟體動物門、瓣鰓綱、蚌科、帆蚌屬,具有優(yōu)良的育珠及抗病性能[14]。從用滅活的嗜水氣單胞菌刺激的池蝶蚌文庫中獲得了HsCyPA的cDNA全長1229 bp, 完整的開放性閱讀框編碼164個氨基酸; 池蝶蚌CyPA除了是一種組成型蛋白, 存在肽基脯酰順反異構(gòu)酶活性外, 可能在水生生物的病原感染防御中同樣發(fā)揮重要作用[15]。到目前為此, 還沒有淡水貝類中有關(guān)CyPA功能研究的報(bào)道。本研究用嗜水氣單胞菌對池蝶蚌進(jìn)行誘導(dǎo), 實(shí)時熒光定量PCR檢測池蝶蚌肝臟、性腺、血淋巴中的CyPA的表達(dá)情況, 初步探討CyPA基因在池蝶蚌免疫應(yīng)答中的作用。同時通過原核表達(dá)純化獲得的池蝶蚌的融合CyPA, 用MTT法研究其對Hela細(xì)胞生長的影響, 為進(jìn)一步了解淡水珍珠貝類CyPA的功能奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌、pET-32a載體、大腸桿菌BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室永久保存種, 池蝶蚌采自江西撫州市洪門水庫的國家級池蝶蚌良種場。池蝶蚌取回后放置于實(shí)驗(yàn)室水族箱中暫養(yǎng), 水溫控制在18—25 ℃ ,每天上下午換曝氣的水各一次。各組織樣品取材于4齡健康池蝶蚌, 誘導(dǎo)組(嗜水氣單胞菌刺激2h、4h、8h、16h、24h、48h)。Hela細(xì)胞系從康為世紀(jì)生物公司購買, 各種分子生物學(xué)試劑分別購自ABI、TaKaRa、Invitrogen 及Sigma 等公司。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取經(jīng)過菌刺激過后的池蝶蚌的性腺、肝和血淋巴和沒經(jīng)過菌刺激的性腺, 用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取總RNA, 按照Invitrogen公司的Super Script Ⅱ Reverse Transcriptase Kit的方法合成cDNA。然后用瓊脂糖凝膠和UV檢測RNA純度。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所獲得的池蝶蚌 CyPA基因 cDNA全長序列, 設(shè)計(jì) CyPA的熒光定量 PCR引物CyPA-1、CyPA-2, 管家基因選擇池蝶蚌的β-肌動蛋白基因(β-actin), 設(shè)計(jì)的引物為A-R-1、A-R-2; 同時選定包括全部ORF在內(nèi)的大小約為650 bp的片段用于表達(dá)蛋白, 設(shè)計(jì)的引物CyPA-up、CyPA-low加入了EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)堿基,設(shè)計(jì)的引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR所用CyPA基因熒光定量引物和β-actin的引物及CyPA表達(dá)的擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used for Real-time PCR and CyPA Expression in this study

1.4 池蝶蚌CyPA熒光定量PCR檢測、蛋白表達(dá)目的片段PCR

以菌刺激過的不同時間段的性腺、肝和血淋巴的cDNA作為模板, 進(jìn)行熒光定量檢測, 每個組織做3個平行樣, 重復(fù)3次實(shí)驗(yàn); 以池蝶蚌性腺組織cDNA為模板, 用特異性表達(dá)引物進(jìn)行PCR反應(yīng), 擴(kuò)增表達(dá)蛋白的目的片段。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為25 μL, SYBR Premix Ex TaqTM(2×)8 μL, cDNA模板 2 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL, ddH2O 8 μL, 反應(yīng)條件為95 ℃ 5min, 95 ℃ 30s, 50 ℃ 30s, 72 ℃ 30s, 35個循環(huán); 擴(kuò)增蛋白表達(dá)片段的反應(yīng)體系為50 μL, 10×PCR buffer 5 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, cDNA模板2 μL, 上游引物(10 mmol/L)1 μL,下游引物(10 mmol/L)1 μL, HiFi Polymerase (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 39.5 μL, 反應(yīng)條件為94 ℃ 4min, 94℃30s, 58 ℃ 30s, 72 ℃ 30s, 35個循環(huán), 72 ℃ , 10min。擴(kuò)增片段經(jīng)過割膠回收后, 再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, DNA–20℃貯存?zhèn)溆?。采?–△△Ct法計(jì)算分析定量的相對表達(dá)值[16]。運(yùn)用SPSS軟件分析CyPA mRNA在池蝶蚌中的表達(dá)情況, P＜0.05差異顯著, P＜0.01差異極顯著。

1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPA重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將回收獲得目的片段與具有氨芐青霉素(Amp)抗性的pET-32a Expression Vectors用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理, 然后用T4 DNA 連接酶將質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與DNA酶切產(chǎn)物進(jìn)行酶聯(lián), 然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化, 通過在具有氨芐青霉素(Amp)抗性的固體培養(yǎng)基中挑克隆, 通過菌液PCR陽性檢測目的片段,陽性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司測序。將正確的陽性克隆接種至20 mL LB培養(yǎng)基, 當(dāng)菌液A600值約為0.6左右時用質(zhì)粒小抽提試劑盒提重組質(zhì)粒, 質(zhì)粒保存在–20℃冰箱備用。

1.6 池蝶蚌CyPA原核表達(dá)及其蛋白純化

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中, 重組菌于37℃振蕩過夜, 取200 μL接種于20 mL LB (50 μg/mL Amp)液體培養(yǎng)基中, 37℃、200 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至A600為0.6—0.8時, 取出1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對照, 其他加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 然后繼續(xù)以相同培養(yǎng)條件培養(yǎng), 分別在培養(yǎng)1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h后各吸取1 mL菌液作為誘導(dǎo)組菌液, 最后收集菌體,用SDS-PAGE膠進(jìn)行分析。為了獲得蛋白含量較高的上清, 根據(jù)閆嘯等[17]的方法在蛋白誘導(dǎo)的過程中對其條件進(jìn)行了相應(yīng)的優(yōu)化: 低溫誘導(dǎo)和培養(yǎng)基優(yōu)化。在確定最佳表達(dá)條件和時間后, 進(jìn)行大量誘導(dǎo),通過超聲波破碎收集上清和包涵體, 采用N端帶有6個連續(xù)組氨酸的親和層析柱, 利用金屬離子螯和柱進(jìn)行親和層析純化。

1.7 MTT法檢測池蝶蚌重組CyPA對Hela細(xì)胞增殖的影響

用胰酶消化對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞, 按2×103細(xì)胞/孔接種于96孔板, 在正常條件下培養(yǎng)過夜, 然后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后, 加入含0.1%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)24h, 使細(xì)胞均一化, 同時將活性和煮沸的重組蛋白CyPA用0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至不同濃度(50、100、200、400、600和800 ng/mL), 在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后, 每孔加入200 μL含不同CyPA蛋白濃度的培養(yǎng)基, 對照組加入等量不含CyPA的0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng), 在細(xì)胞培養(yǎng)72h后, 每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL, 37℃繼續(xù)孵育4h; 吸去培養(yǎng)基, 每孔加入200 μL DMSO溶液, 搖床避光振搖直至顯微鏡下觀察板孔內(nèi)藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解, 然后在酶標(biāo)儀上檢測A570值。

2 結(jié)果

2.1 嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)池蝶蚌CyPA基因在性腺、肝臟和血淋巴中不同時間段的表達(dá)

通過熒光定量PCR檢測池蝶蚌CyPA基因在嗜水氣單胞桿菌誘導(dǎo)下在性腺、肝臟和血淋巴不同時間段的表達(dá)差異: 池蝶蚌CyPA基因在性腺、肝臟和血淋巴在誘導(dǎo)2h時, 發(fā)現(xiàn)已經(jīng)開始出現(xiàn)上調(diào), 在誘導(dǎo)4h均達(dá)到表達(dá)峰值, 除了性腺在誘導(dǎo)48h出現(xiàn)小幅度的上調(diào), 肝臟在16h出現(xiàn)小幅度上調(diào)外, 3個組織的表達(dá)量基本出現(xiàn)下調(diào)趨勢, 肝臟和血淋巴在誘導(dǎo)48h后的表達(dá)量最低(圖1—3)。

圖1 不同誘導(dǎo)時間池蝶蚌肝臟中CyPA表達(dá)的變化Fig. 1 Change of CyPA gene expression level in liver of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

圖2 不同誘導(dǎo)時間池蝶蚌性腺中CyPA表達(dá)的變化Fig. 2 Change of CyPA gene expression level in gonad of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

2.2 CyPA蛋白表達(dá)目的片段和目的片段陽性檢測及其重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

用特異性表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測, 在650 bp左右, 與目的片段大小相同; 菌液PCR陽性檢測結(jié)果與上海生工測序一致; EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-32a-CyPA, 得到了與預(yù)期片段大小相符的外源基因片段, 驗(yàn)證了目的表達(dá)片段。

2.3 CyPA融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及其純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-CyPA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中, 重組菌通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CyPA融合蛋白, 未誘導(dǎo)的重組菌作為對照組, 對各誘導(dǎo)時間菌體進(jìn)行變性不連續(xù)SDS-PAGE膠電泳, 發(fā)現(xiàn)在1—8h 里均出現(xiàn)了一條相對分子量約37 kD的蛋白條帶, 但在對照組0h中沒有出現(xiàn)類似的條帶, 說明重組菌成功表達(dá)了CyPA融合蛋白; 用His-Bind Kit (Novagen公司)純化帶(His)6-標(biāo)簽的CyPA上清, 包涵體用KCL染色切膠回收法, 檢測結(jié)果表明純化效果較好, 得到了單一的目的條帶。通過比較LB培養(yǎng)基誘導(dǎo), LB培養(yǎng)基低溫誘導(dǎo)和甘露醇培養(yǎng)基低溫誘導(dǎo)三者之間純化的結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)在甘露醇培養(yǎng)基低溫誘導(dǎo)條件下蛋白表達(dá)量最高。

2.4 池蝶蚌重組CyPA對Hela細(xì)胞增殖的影響

MTT法是檢測活細(xì)胞最直接的實(shí)驗(yàn)方法, 實(shí)驗(yàn)測得OD值的高低與活細(xì)胞成正比。實(shí)驗(yàn)用池蝶蚌CyPA刺激Hela細(xì)胞, 進(jìn)行MTT法毒性實(shí)驗(yàn), 通過酶標(biāo)儀檢獲得OD值來分析對細(xì)胞的生長情況。結(jié)果如表2所示, 活性的CyPA對Hela細(xì)胞有顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05), 最佳刺激濃度是100 ng/mL, 此時A570的平均值為1.1509(±0.05), 對照組是0.9704 (±0.05), 通過增長率的計(jì)算方法得出最大增殖率為18.5%; 濃度小于100 ng/mL時, 刺激作用逐步上升, 但當(dāng)濃度大于100 ng/mL時, 刺激效果呈現(xiàn)下降趨勢。將CyPA煮沸 5min, 將變性失活的蛋白稀釋到相同濃度來刺激Hela細(xì)胞, 結(jié)果顯示, 煮沸后的CyPA蛋白的作用顯著降低, A570在0.9160—0.9808。[增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A570–對照組A570)/對照組A570]

3 討論

圖3 不同誘導(dǎo)時間池蝶蚌血淋巴中CyPA表達(dá)的變化Fig. 3 Change of CyPA gene expression level in haemocytes of H. schlegelii after A. hydrophila stimulation at different times

表2 MTT法檢測HsCyPA對Hela細(xì)胞的促增殖作用結(jié)果Tab.2 The results of HsCyPA promoting proliferation of Hela Determined by MTT assay

通過檢測池蝶蚌CyPA組織分布表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)在肝臟和性腺中表達(dá)量顯著高于其他組織。研究發(fā)現(xiàn), CyPA在性腺、肝臟和血淋巴中的表達(dá)量高于其他組織, 在防御病原菌感染機(jī)制中也擔(dān)當(dāng)相關(guān)角色[13]。在無脊椎動物中并沒有發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞抗體介導(dǎo)的體液免疫機(jī)制和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)機(jī)制, 主要是通過血淋巴、肝胰腺及一些體液免疫因子參與機(jī)體的免疫防御來行使免疫功能[18,19]。通過用嗜水氣單胞桿菌對池蝶蚌進(jìn)行刺激后, 發(fā)現(xiàn)CyPA在血淋巴中的mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化, CyPA mRNA的表達(dá)量在誘導(dǎo)4h后顯著上升(P＜0.01), 并達(dá)到峰值,說明CyPA在血細(xì)胞免疫防御細(xì)菌感染機(jī)制中起作用。在性腺中, CyPA mRNA的表達(dá)量在誘導(dǎo)4h后顯著上升(P＜0.01), 并達(dá)到峰值, 誘導(dǎo)2h后池蝶蚌性腺CyPA的表達(dá)量已經(jīng)開始上升, 誘導(dǎo)8h后出現(xiàn)下降趨勢, 誘導(dǎo)24h后表達(dá)量降到最低, 48h表達(dá)量出現(xiàn)小幅度的上調(diào), CyPA在肝臟中的表達(dá)水平也出現(xiàn)了相似的表達(dá)趨勢。Song等[12]在研究櫛孔扇貝CyPA時同樣發(fā)現(xiàn), 經(jīng)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)誘導(dǎo)4h后性腺中CyPA表達(dá)量顯著增加, 和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合,進(jìn)一步證實(shí)CyPA在貝類防御細(xì)菌感染方面起著重要作用。Yeh等[20]研究中也發(fā)現(xiàn), 經(jīng)愛德華桿菌誘導(dǎo)的斑點(diǎn)叉尾(Lepisosteus oculatus)卵巢細(xì)胞中CyPA表達(dá)量明顯增加, 表明CyPA在愛德華桿菌感染早期階段扮演防御的角色。Qiu等[13]發(fā)現(xiàn)在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中CyPA基因, 用LPS刺激后在肝胰腺中表達(dá)量也出現(xiàn)顯著上調(diào), 再次證實(shí)CyPA對防御細(xì)菌感染起著重要作用。綜上得出: 在嗜水氣單胞菌刺激后, 池蝶蚌CyPA在性腺、血淋巴和肝臟中表達(dá)量很高, 在4h時表達(dá)水平達(dá)到峰值, 說明池蝶蚌的CyPA在性腺、血淋巴和肝臟的防御外來細(xì)菌機(jī)制中起著重要作用, 然而CyPA在對貝類免疫機(jī)制仍然有許多未知, 仍需要進(jìn)一步深入研究。

已有報(bào)道發(fā)現(xiàn), CyPA在子宮內(nèi)膜癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥組織中表達(dá)明顯上調(diào), 并證實(shí)外源性的 CyPA蛋白能促進(jìn)宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞的增殖[21,24], 研究還發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞組織和細(xì)胞系中 CyPA表達(dá)上調(diào)可能參與肝癌細(xì)胞趨化作用、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、抗凋亡等過程[25,26]。在研究肺癌過程中 Yang等[27]比較了不同的肺癌細(xì)胞系和正常肺細(xì)胞系中 CyPA的表達(dá)水平情況, 篩選到了一株CyPA相對表達(dá)最高的肺癌細(xì)胞株H446, 并發(fā)現(xiàn)在外源重組CyPA的刺激下對H446細(xì)胞的增殖起到了一定的上調(diào)作用; Li等[28]證實(shí), CyPA在人胰腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)可通過與其受體EMMPRIN的結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。在胰腺癌患者中, CyPA的表達(dá)與腫瘤大小, TNM分期, 淋巴轉(zhuǎn)移及CA199的表達(dá)也相關(guān)[29]。為了研究池蝶蚌 CyPA是否具有促進(jìn)細(xì)胞增生功能, 本研究采用池蝶蚌CyPA對Hela細(xì)胞進(jìn)行了體外刺激實(shí)驗(yàn), 通過MTT法毒性實(shí)驗(yàn), 相對于對照組, 發(fā)現(xiàn)在加入了高濃度活性重組 CyPA蛋白的Hela細(xì)胞生長更快, 這一現(xiàn)象也首次證實(shí)了淡水珍珠蚌池蝶蚌CyPA對Hela細(xì)胞有一定促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。池蝶蚌CyPA這種對Hela細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用, 可能與CyPA具有PPIase活性有關(guān),在氧化應(yīng)激條件下, 它能介導(dǎo)活性氧遞質(zhì)對細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶-1和2的激活, 通過增加癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力, 調(diào)整促癌信號來促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂, 最終達(dá)到 Hela細(xì)胞的增殖作用。綜上表明, 池蝶蚌 CyPA是一個功能廣泛的分子, 相關(guān)功能及其作用機(jī)制有待更加進(jìn)一步深入的研究。

[1] Feng W H, Xin Y. Progress in research on cyclophilin A and malignant tumors [J]. Tumor, 2013, 33(10): 928—934 [馮文華, 辛彥. 親環(huán)素A與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展．腫瘤, 2013, 33(10): 928—934]

[2] Qian Z, Yue W T, Li B L. Progress of CypA and lung cancer-related research [J]. Chinese Journal of Lung Cancer, 2010, 13(8): 827—831 [錢哲, 岳文濤, 李寶蘭. CypA的生物學(xué)功能及其與肺癌相關(guān)的研究進(jìn)展．中國肺癌雜志, 2010, 13(8): 827—831]

[3] Qian Z, Zhao X, Jiang M, et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9 [J]. BMC Cancer, 2012, (12): 442

[4] Qi Y J, He Q Y, Ma Y F, et al. Proteomic identification of malignant ransformation-related proteins in esophngeal squamans cell carcinoma [J]. Cell Biochemistry, 2008, 104(5): 1625—1635

[5] Chahed K, Kabhage M, Hamrita B, et al. Detection of protein alterations in male breast cancer using two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: The involvement of several pathways in tumorigenesis [J]. Clinica Chimica Acta, 2008, 388(1—2): 106—114

[6] Chaunmd P, Rahmun M A, Hunt T, et al. Monitoring mouse prostate development by profiling and imaging mass spectrometry [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2008, 7(2): 411—423

[7] Takahashi M, Suzuki S, Ishikawa K. Cyclophilin A-EMMPRIN interaction induces invasion of head and neck squamous cell carcinoma [J]. Oncology Reports, 2012, 27(1): 198—203

[8] Huang C, Sun Z, Sun Y, et al. Association of increased ligand cyclophilin A and receptor CD147 with hypoxia, angiogenesis, metastasis and prognosis of tongue squamous cell carcinoma [J]. Histopathology, 2012, 60(5): 793—803

[9] Lee J. Role of cyclophilin a during oncogenesis [J]. Archives Pharmacal Research, 2010, 33(2): 181—187

[10] Ding Z K, Xin W L, Chen X L, et al. Cloning and expression analysis of cyclophilins A gene from Litop enaeus vannamei [J]. Journal of Wuhan University, 2011, 57(4): 323—328 [丁兆坤, 辛文倫, 陳秀荔, 等. 凡納濱對蝦親環(huán)素A基因的克隆及表達(dá)分析. 武漢大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 57(4): 323—328]

[11] Towers G J. The control of viral infection by tripartite motif proteins and cyclophilin A [J]. Retrovirology, 2007, 4(40): 40—50

[12] Song X Y, Wang L L, Song L S, et al. A cyclophilin A inducible expressed in gonad of zhikong scallop Chlamys farreri [J]. Molecular Biology Reports, 2009, 36(6): 1637—1645

[13] Qiu L, Jiang S, Huang J, et al. Molecular cloning and mRNA expression of cyclophilin A gene in black tiger shrimp (Penaeus monodon) [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2009, (26): 115—121

[14] He S H, Peng K, Hong Y J, et al. Molecular properties and immune defense of two ferritin subunits from freshwater pearl mussel, Hyriopsis schlegelii [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, (34): 865—874

[15] Xie K, Xu L, Sheng J Q, et al. Construction of full-length cDNA library of hemocyte from Aeromonas hydrophila challenged Hyriopsis schlegeli and sequence analysis of cyclophilin A [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(5): 783—789 [謝凱, 徐靈, 盛軍慶, 等. 嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)的池蝶蚌血細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建和親環(huán)蛋白(Cyp A)基因的序列分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(5): 783—789]

[16] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real—time quantitative PCR and the 2(-Delta DeltaC(T)) mehtod [J]. Methods, 2001, 25(4): 402—408

[17] Yan X, Xu L R, Guan Y X, et al. Soluble expression of recombinant cyclophilin A in Escherichia coli [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture & Life Science), 2010, 36(4): 363—369 [閻嘯, 徐立仁, 關(guān)怡新, 等. 重組親環(huán)蛋白A的可溶性表達(dá). 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 36(4): 363—369]

[18] Zhou Y C, Pan J P. Progress on researches of cellular and humoral defense mechanisms in molluscs [J]. Journal of Fisheries of China, 1997, 21(4): 449—454 [周永燦, 潘金培.貝類細(xì)胞和體液的防御機(jī)制研究進(jìn)展. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1997, 21(4): 449—454]

[19] He S H. Characteristics and expression analysis of two ferritin subunits from freshwater pearl mussel, Hyriopsis schlegelii [D]. Nanchang University. 2012 [何書豪. 池蝶蚌鐵蛋白基因的特征與表達(dá)分析.碩士學(xué)位論文, 南昌大學(xué). 2012]

[20] Yeh H Y, Klesius P H. Channel Catfish, Ictalurus punctatus, cyclophilin A and B cDNA characterization and expression analysis [J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 121(3/4): 370—377

[21] Obchoei S, Weakley S M, Wongkham S, et al. Cyclophilin A enhances cell proliferation and tumor growth of liver fluke-associated cholangiocarcinoma [J]. Molecular Cancer, 2011, 10(1): 102

[22] Li Z, Zhao X, Bai S, et al. Proteomics identification of cyclophilin A as a potential prognostic factor and therapeutic target in endometrial carcinoma [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2008, 7(10): 1810—1823

[23] Suzuki J, Jin Z G, Meoli D F, et al. Cyclophilin A is secreted by a vesicular pathway in vascular smooth muscle cells [J]. Circulation Research, 2006, 98(6): 811—817

[24] Wang Y, Yao H, Wen L, et al. Establishment and functional analysis of hepatocellular carcinom a cell line which overexpressed CypA [J]. Modern Oncology, 2010, 18(8): 1473—1476 [王宇, 姚輝, 溫麗, 等. 高表達(dá)CypA肝癌細(xì)胞系的建立及功能的初步研究．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2010, 18(8): 1473—1476]

[25] Zhang M, Dai C, Zhu H, et al. Cyclophilin A promotes human hepatocellular carcinoma cell metastasis via regulation of MMP3 and MMP9 [J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2011, 357(1—2): 387—395

[26] Lee J. Novel combinational treatment of cisplatin with cyclophilin A inhibitors in human heptocellular carcinomas [J]. Archives Pharmacal Research, 2010, 33(9): 1401—1409

[27] Yang H, Chen J, Yang J, et al. Cyclophilin A is upregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 361(3): 763—767

[28] Li M, Zhai Q, Bharedwaj U, et al. Cyclophilin A is overexpressed in human pancreatic cancer cells and stimulates cell proliferation through CDl47 [J]. Cancer, 2006, 6(10): 2284—2294

[29] LIU F H. The mechanism and the effect of interaction of CypA and HIF on the ability of invasion and metastasis of pancreatic cancer [D]. Tianjin Medical University. 2012 [劉鳳華. CypA胰腺癌生物學(xué)行為的及影響的機(jī)制研究.博士學(xué)位論文, 天津醫(yī)科大學(xué). 2012]

THE EXPRESSION OF CYCLOPHILIN A (CyPA) IN HYRIOPSIS SCHLEGELII IN RESPONSE TO PATHOGENS AND ITS EFFECT ON THE GROWTH OF HELA CELLS

LUO Chun1, XU Ling1, HE Jing1, SHI Jian-Wu1, SHENG Jun-Qing1, PENG Kou1, WANG Jun-Hua1, HUANG Bin2and HONG Yi-Jiang1
(1. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 2. Jiangxi Province Fisheries Technology Extension Station, Nanchang 330046, China)

In this study we explored the expression of Hyriopsis schlegelii Cyclophilin A in response to infection and the effect of this protein on the growth of Hela cells. The mRNA level of this gene in the haemocytes, liver and gonad was measured with Real-time PCR after the Aeromonas hydrophila challenge. It was observed that the transcription of HsCyPA in haemocytes, gonad and liver was significantly up-regulated at 4h after the challenge and then decreased at 8h. These results suggested that HsCyPA might be involved in the immune response. The complete ORF of HsCyPA gene was subcloned into pET-32a (+) prokaryotic expression vector, and then expressed in E. coli BL21 (DE3). After the optimization of induction conditions, the soluble fusion protein was purified with Ni-NTA affinity chromatography. To test the effect of this recombinant protein on Hela cells, we diluted it into certain concentrations (50, 100, 200, 400, 800 ng/mL) and applied them into Hela cell strains through MTT assay. It was revealed that the recombinant HsCyPA could promote the proliferation of Hela cells, and the proliferation rate reached the maximum (18.5%) when the HsCyPA concentration was 100 ng/mL. These preliminary results indicated that Cyclophilin A could be a multi-functional protein which might participate in immune responses and cell growth regulation.

Hyriopsis schlegelii; Cyclophilin A; Real-time PCR; Prokaryotic Expression; Hela cell; MTT assay

S944.4

A

1000-3207(2015)03-0475-07

10.7541/2015.63

2014-06-16;

2014-11-05

國家自然科學(xué)基金(31160534); 江西省科技落地計(jì)劃(KJLD12001); 江西省自然科學(xué)基金(20122BAB204016)資助

羅春(1988—), 男,江西贛州瑞金人; 碩士; 主要研究方向水生生物遺傳育種學(xué)。E-mail: 517684206@qq.com

洪一江(1963—),男,福建南安人; 教授, 博導(dǎo); 主要研究方向?yàn)樗鷦游镞z傳育種學(xué)。E-mail: yijianghong@126.com