閆 龍宋 娜王 俊鹿志創(chuàng)高天翔

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島 266002; 3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 大連 116000; 4. 浙江海洋學院水產(chǎn)學院, 舟山 316022)

基于線粒體控制區(qū)的中華絨螯蟹群體遺傳多樣性分析

閆 龍1宋 娜1王 俊2鹿志創(chuàng)3高天翔4

(1. 中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所, 青島 266003; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 青島 266002; 3. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 大連 116000; 4. 浙江海洋學院水產(chǎn)學院, 舟山 316022)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis H. Milne Edwards)隸屬于十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)、絨螯蟹屬(Eriocheir), 廣泛分布于我國沿海各大水系[1]。中華絨螯蟹肉味鮮美、營養(yǎng)價值高, 是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟物種。目前, 中華絨螯蟹的增殖放流和水產(chǎn)養(yǎng)殖等生產(chǎn)活動的開展已造成不同水系種質資源嚴重混雜[2,3]。因此, 為深入了解不同水系中華絨螯蟹的遺傳特征和種質差異, 有效管理利用和保護中華絨螯蟹資源, 對不同水系中華絨螯蟹的遺傳多樣性和群體遺傳結構研究勢在必行。

分子生物學技術的發(fā)展為研究生物的遺傳變異提供了有效的手段。進化速度快、較小的基因組、結構簡單而穩(wěn)定、世代傳遞過程中幾乎不發(fā)生重組、無組織特異性、單性母系遺傳等特征使線粒體DNA(mtDNA)成為進化和群體遺傳學研究的有效標記[4,5]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)因缺乏編碼選擇壓力而成為線粒體基因組中進化速率最快的基因, 比線粒體PNA其他基因片段更適合用于種間或種下水平的遺傳學研究[6,7]。

目前, 國內外學者已對中華絨螯蟹的形態(tài)學和遺傳學開展了大量研究。形態(tài)學方面, 有學者運用多元統(tǒng)計方法對中國沿海不同水域中華絨螯蟹的形態(tài)差異進行研究[8,9],唐伯平等[10]基于光鏡和掃描電鏡對中華絨螯蟹的觸角形態(tài)特征進行了研究; 遺傳學方面, Sui等[11]以及Xu和Chu[12]分別運用微衛(wèi)星(SSR)和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)核基因標記對國內各大水系的中華絨螯蟹開展了群體遺傳學分析; 另有諸多學者運用線粒體COⅠ、Cyt b等基因片段對中華絨螯蟹開展了群體遺傳學研究[13-15]。迄今, 尚未見mtDNA控制區(qū)序列在中華絨螯蟹群體遺傳學研究中的報道。本研究采用mtDNA控制區(qū)高變區(qū)序列對中華絨螯蟹四個野生群體的遺傳多樣性及群體遺傳結構展開研究, 以揭示不同水系中華絨螯蟹的遺傳差異,探討其遺傳多樣性水平, 為中華絨鰲蟹資源的合理開發(fā)利用與保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用中華絨螯蟹樣品于1999年 7月至 2013年 10月間分別采自丹東(DD)、盤錦(PJ)、墾利(KL)、南京(NJ), 采用地點如圖1所示。另外, 我們還采集了廣西北海合浦絨螯蟹(Eriocheir hepuensis)19個個體作為外群來進行比較分析。樣品采樣方式為天然水域抓捕或地籠網(wǎng)捕捉, 新鮮或冷凍樣品送至中國海洋大學漁業(yè)生態(tài)實驗室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 中華絨螯蟹采樣地點Fig. 1 Sampling sites of E. sinensis

1.2 DNA提取與PCR擴增

取中華絨螯蟹螯足肌肉組織約100 mg, 經(jīng)細胞裂解液STE和蛋白酶K完全消化, 采用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA, 100 μL超純水溶解, 4℃保存。

根據(jù)GenBank發(fā)布的中華絨螯蟹線粒體基因組全序列[16]設計中華絨螯蟹和合浦絨螯蟹控制區(qū)高變區(qū)引物序列為YL-F: 5′-ACGTAACTGAAATGCTGTTC-3′和YL-R: 5′-ACCCGTTTCCCCTCTAGAGGA-3′。PCR反應體系為25 μL, 包括: 基因組DNA(20 ng), 1.25 U Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司), 200 nmol/L的正反向引物, 200 μmol/L的每種dNTP, 10 mmol/L Tris pH 8.3, 50 mmol/L KCl和1.5 mmol/L MgCl2(大連寶生物工程有限公司)。PCR循環(huán)參數(shù)為: 95℃預變性5min, 95℃變性45s, 50℃退火50s, 72℃度延伸1min, 循環(huán)35次, 然后72℃后延伸10min。所有PCR均在Biometra熱循環(huán)儀上完成。每組PCR均設陰性對照用來檢測是否存在污染, 取2 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 用UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒對目的片段進行回收純化, 然后送生物公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用DNAStar(DNASTAR, inc, Madison, USA)軟件包對序列進行比對排序并輔以人工校正。運用MEGA4.0[17]計算序列的堿基組成、多態(tài)性、序列間的轉換顛換比。利用 PAUP和 Modeltest3.7[18]軟件篩選核苷酸最佳替代模型并計算不同位點間異質性的gamma分布性狀參數(shù)。以合浦絨螯蟹為外群, 基于模型篩選所得參數(shù)在 MEGA4.0軟件中構建 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹, 系統(tǒng)樹的可靠性采用 1000次重抽樣評估。利用Arlequin3.0[19]軟件計算單倍型數(shù)、單倍型多樣度、核苷酸多樣度等遺傳學參數(shù); 計算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù) FST值, 并進行分子差異分析(AMOVA)和確切P檢驗, 以評估中華絨螯蟹的群體遺傳結構。

2 結果

2.1 序列組成與變異分析

對4個群體共84個中華絨螯蟹個體擴增后所得目的片段長度為 475 bp, 其中包括 18 bp的 tRNA序列和457 bp的控制區(qū)高變區(qū)序列。18 bp的tRNA序列內無變異位點, 457 bp的控制區(qū)高變區(qū)共檢測到58個多態(tài)位點, 31個簡約信息位點, 47處轉換和9處顛換(轉換顛換比為5.2), 同時有 8處插入/缺失。在堿基組成上, A+T含量(81.58%)明顯高于G+C含量(18.42%)。58個多態(tài)位點定義了41個單倍型, 包括28個獨有單倍型和13個共享單倍型。共享單倍型中6個單倍型被兩個以上群體的個體所共享。Hap.16是分布最普遍的單倍型, 被三個群體的 13個個體共享, 丹東群體和南京群體之間沒有出現(xiàn)共享單倍型(表2)。合浦絨螯蟹與中華絨螯蟹在線粒體控制區(qū)序列上存在較大差異。19個合浦絨螯蟹的目的片段長度為476 bp, 在18 bp的tRNA序列內也無變異位點, 在458 bp的控制區(qū)高變區(qū)序列共檢測到55個多態(tài)位點, 定義了19個單倍型, 其中包括 44處轉換和2處顛換, 轉換顛換比為22, 同時有9處插入/缺失。在堿基組成上, A+T含量(80.13%)明顯高于G+C含量(19.87%)。兩種絨螯蟹控制區(qū)的A+T含量均高于G+C, 但中華絨螯蟹的G+C含量更低。

總體來看, 中華絨螯蟹遺傳多樣性處于較高水平,單倍型多樣度、核苷酸多樣度平均值分別為 0.958±0.010和0.016±0.009(表1)。南京群體的單倍型多樣度為0.848± 0.070, 核苷酸多樣度為 0.010±0.006, 略低于其他三個群體。四個群體遺傳多樣性水平從高到低依次為: 墾利＞盤錦＞丹東＞南京。合浦絨螯蟹的單倍型多樣度為1.000±0.017,核苷酸多樣度為0.027±0.014, 均高于中華絨螯蟹。

2.2 群體遺傳結構分析

兩兩群體間遺傳分化指數(shù) FST值顯示: 丹東群體與其他群體間FST值較大, 且經(jīng)Bonferroni校正后差異均顯著(P＜0.05); 盤錦群體與其他群體間 FST值較小, 經(jīng)Bonferroni校正后差異顯著(P＜0.05); 墾利群體和南京群體之間FST值最小, 且差異不顯著(P＞0.05)(表3)。將所有群體作為一個組群進行 AMOVA分析的結果顯示: 組內

群體間遺傳差異極顯著(ΦST=0.0681, P=0)。為進一步檢測群體遺傳結構, 運用確切 P檢驗來揭示群體間是否存在隨機交配現(xiàn)象。在 0.05置信水平下, 除墾利群體和南京群體之間存在隨機交配現(xiàn)象外, 其他兩兩群體間都不存在隨機交配(P＜0.05)(表3)。以上結果均表明: 丹東群體與其他三個群體間存在中度且顯著的遺傳分化, 盤錦群體與墾利、南京群體間存在微弱但顯著的遺傳分化, 墾利群體和南京群體之間遺傳差異最小且不顯著。

表1 中華絨螯蟹各群體的采樣信息和遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 The sample information and genetic diversity parameters of different populations for E. sinensis

表2 中華絨螯蟹單倍型在不同群體間分布情況Tab. 2 Distribution of haplotype of populations of E. sinensis

表3 中華絨螯蟹群體間的遺傳分化指數(shù)(下對角線)和確切P值(上對角線)Tab. 3 Pairwise FST(below diagonal) and exact P values (above diagonal) among E. sinensis populations

通過PAUP和Modeltest軟件計算得到中華絨螯蟹控制區(qū)的核苷酸最佳替代模型為 TVM+I+G(I=0.54, G=0.97)。以合浦絨螯蟹為外群, 基于篩模型所得參數(shù)構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示: 中華絨螯蟹鄰接關系樹的拓撲結構比較簡單, 沒有檢測到與采樣地點相對應的分支,不存在顯著的譜系結構(圖 2)。單倍型網(wǎng)絡圖與 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結果一致, 也沒有出現(xiàn)與地理分布相對應的譜系結構(圖3)。

圖2 中華絨螯蟹單倍型網(wǎng)絡關系圖Fig. 2 Reduced median-network showing genetic relationship in E. sinensis

3 討論

遺傳多樣性的高低是評價物種對環(huán)境適應能力和物種進化潛力的重要依據(jù)。遺傳多樣性越豐富, 物種對環(huán)境變化的適應能力越強, 遺傳多樣性的貧乏會導致物種低的進化適應性, 使得物種易于遭受生態(tài)環(huán)境改變的影響[20]。種群遺傳結構是指遺傳多樣性在種內和種間的分布, 即遺傳分化。掌握種群的遺傳結構可以明確物種在分布范圍內是否存在隨機交配, 確定物種的管理單元[21]。20世紀70年代以來, 隨著河蟹養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展, 商品蟹流通、養(yǎng)殖親蟹移植等人為因素打破了各水系中華絨螯蟹天然分布格局, 導致不同水系中華絨螯蟹種質資源混雜、退化情況越來越嚴重[22—24]。因此, 準確了解中華絨螯蟹的遺傳多樣性水平和群體遺傳結構可以為其資源的可持續(xù)利用與保護提供依據(jù)。

圖3 基于鄰接法構建的中華絨螯蟹系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree in E. sinensis based on neighbor joining method

本研究結果表明, 中華絨螯蟹的控制區(qū)序列的堿基組成與三疣梭子蟹[25]以及合浦絨螯蟹一致, 都表現(xiàn)出A+T含量明顯偏高的特點。核苷酸多樣度是衡量線粒體DNA遺傳多樣性的一個重要指標。本研究中丹東、盤錦、墾利三個群體的核苷酸多樣度處于較高水平, 南京群體的核苷酸多樣度明顯低于其他三個群體, 但維持在中等水平。運用Cyt b基因的研究結果也表明南京中華絨螯蟹的核苷酸多樣度明顯低于其他水系[26]。這可能與長江水系中華絨螯蟹過度捕撈利用有關, 長期的過度捕撈和水體污染、生境破壞等造成中華絨螯蟹有效種群數(shù)量減少,可能經(jīng)歷了瓶頸效應[27,28], 導致南京群體核苷酸多樣度低于其他群體。

有關中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性研究報道較多,運用不同分子標記得到的結果有所差異。運用AFLP、RAPD等的研究表明中華絨螯蟹的遺傳多樣性處于較低水平[12,14,29]; 而運用微衛(wèi)星和Cyt b的研究表明中華絨螯蟹的遺傳多樣性水平較高[11,13]。本研究結果支持中華絨螯蟹遺傳多樣性處于較高水平的結論。本研究4個中華絨螯蟹群體的單倍型多樣度水平均較高, 南京群體的單倍型多樣度雖略低于其他三個群體, 但差異不明顯。中華絨螯蟹廣泛分布于中國沿海各大水系且具有較強的繁殖力和環(huán)境適應能力, 大的有效群體可能是造成中華絨螯蟹遺傳多樣性水平較高的原因。另外, 多年來不同水系中華絨螯蟹之間頻繁的基因交流在加劇了各水系中華絨螯蟹混雜的同時[23—25], 也可能在一定程度上提高了中華絨螯蟹的遺傳多樣性。

Sui等[11]和Chang等[30]運用SSR對中華絨螯蟹群體遺傳學度研究表明: 遼河水系與黃河水系、長江水系中華絨螯蟹群體之間存在顯著的遺傳差異, 而黃河水系與長江水系中華絨螯蟹群體間遺傳差異不明顯。本研究結果與上述研究結果相近, 除墾利與南京中華絨螯蟹群體間遺傳分化不顯著外, 其他兩兩群體之間都存在不同程度的遺傳差異。中華絨螯蟹有限的擴散能力和不同群體沿岸距離較遠可能是造成群體間產(chǎn)生顯著遺傳分化的主要原因。雖然中華絨螯蟹蚤狀幼體可隨海流沿岸被動遷移, 但其蚤狀幼體的浮游期短且中國沿岸海流流速緩慢[31,32], 可能尚不足以使不同水系中華絨螯蟹群體間產(chǎn)生基因交流[11]。生存環(huán)境的差異和地理隔離使得不同地理群體為適應各自環(huán)境而發(fā)生定向變異, 經(jīng)過長期積累而最終出現(xiàn)遺傳分化。雖然四個中華絨螯蟹群體之間存在一定的遺傳結構,但不同地理群體之間還未能積累足夠多的遺傳變異。因此NJ系統(tǒng)樹和單倍型網(wǎng)絡圖均未檢測到與采樣地點相對應的譜系結構。商品蟹流通、增殖放流和人工養(yǎng)殖中親蟹及苗種的異地使用可能是導致南京群體和墾利群體間不存在遺傳分化的主要原因。

綜上所述, 丹東、盤錦、墾利三個中華絨螯蟹群體的遺傳多樣性均處于較高水平。南京群體的遺傳多樣性略低于其他三個群體, 需盡快采取措施對其野生資源進行保護, 以實現(xiàn)資源的可持續(xù)開發(fā)。不同水系中華絨螯蟹群體間存在一定程度的遺傳分化, 必須建立科學有效的監(jiān)督管理體系, 防止盲目的人工移植和引種導致各水系中華絨螯蟹種質資源退化和優(yōu)良性狀的丟失, 保證中華絨螯蟹野生資源得到有效保護和合理開發(fā)利用。

致謝:

感謝南京市農(nóng)林局漁政處孫希福在采樣過程中提供的幫助。感謝李寧博士和李淵在數(shù)據(jù)分析方面給予的幫助。

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STUDIES ON GENETIC DIVERSITY OF CHINESE MITTEN CRAB ERIOCHEIR SINENSIS BASED ON MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION

YAN Long1, SONG Na1, WANG Jun2, LU Zhi-Chuang3and GAO Tian-Xiang4
(1. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266002, China; 3. Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116000, China; 4. School of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

中華絨螯蟹; 線粒體控制區(qū); 單倍型多樣度; 核苷酸多樣度; 遺傳結構; 遺傳多樣性

Chinese mitten crab; mtDNA control region; Haplotype diversity; Nucleotide diversity; Genetic structure; Genetic diversity

Q349+.1

A

1000-3207(2015)03-0615-06

10.7541/2015.81

2014-05-26;

2014-08-25

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303050)資助

閆龍(1988—), 男, 甘肅高臺人; 碩士; 主要從事水生生物系統(tǒng)發(fā)育與遺傳多樣性研究。E-mail: 307605811@qq.com

高天翔, E-mail: gaotianxiang0611@163.com