莫運(yùn)才， 曾令杰， 黃 涵， 馮鴻耀， 葉靜微， 李景彪， 周叢然

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

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UV-B輻射對(duì)鐵皮石斛葉片光合色素、類黃酮及PAL酶活性的影響

莫運(yùn)才， 曾令杰*， 黃 涵， 馮鴻耀， 葉靜微， 李景彪， 周叢然

(廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

為探討環(huán)境中太陽(yáng)紫外線(UV-B)輻射的增強(qiáng)對(duì)鐵皮石斛幼苗生理代謝的影響，以藥用植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為材料，進(jìn)行5.1 μW/cm2和15.6 μW/cm2強(qiáng)度的UV-B輻射試驗(yàn)，比較鐵皮石斛葉片光合色素含量、類黃酮含量和PAL酶活性變化差異。結(jié)果表明：在UV-B輻射下，鐵皮石斛葉片葉綠素含量均降低，且隨著UV-B輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，15.6 μW/cm2的UV-B輻射處理降低幅度越大；在UV-B輻射處理期間，5.1 μW/cm2輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和PAL酶活性均高于CK；而15.6 μW/cm2UV-B輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和PAL酶活性在第8天達(dá)最大值后迅速降低。表明，低強(qiáng)度UV-B輻射下，鐵皮石斛可以被誘導(dǎo)合成較多的類胡蘿卜素和類黃酮等紫外保護(hù)物質(zhì)以抵抗UV-B輻射，使植株不受到傷害。而高強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的UV-B輻射對(duì)鐵皮石斛的傷害較大。

鐵皮石斛； UV-B輻射； 光合色素； 類黃酮； PAL酶

平流層臭氧層減薄導(dǎo)致太陽(yáng)紫外線B(UV-B，波長(zhǎng)為280～320 nm)輻射量增加[1-3],地表UV-B輻射目前已成為影響植物生長(zhǎng)的重要生態(tài)因子。UV-B輻射能對(duì)植物的光合器官、蛋白質(zhì)及質(zhì)膜等造成損傷[4-5]。然而植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，其本身有應(yīng)對(duì)UV-B輻射的保護(hù)機(jī)制，如增加UV吸收物質(zhì)含量來(lái)抵抗UV-B輻射等[5-6]。鐵皮石斛對(duì)光敏感，而UV-B輻射對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，試驗(yàn)在模擬不同蔭蔽度的野生環(huán)境下，研究UV-B輻射強(qiáng)度下鐵皮石斛光合色素含量、類黃酮含量和PAL酶活性的變化，探討環(huán)境中UV-B輻射的增強(qiáng)對(duì)鐵皮石斛幼苗生理代謝的影響，為鐵皮石斛的仿野生栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 鐵皮石斛幼苗的培養(yǎng)

在實(shí)驗(yàn)室培育的鐵皮石斛無(wú)菌幼苗中，挑選色綠、健壯、高5～6 cm、生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的塑料杯中，在溫度(25±2)℃，2 000 lx光照強(qiáng)度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天光照12 h。培養(yǎng)一段時(shí)間后，篩選生長(zhǎng)狀況基本一致的組培苗進(jìn)行UV-B輻照試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共3個(gè)處理，即幼苗在日光燈照射下，進(jìn)行強(qiáng)度分別為5.1 μW/cm2(處理1)和15.6 μW/cm2(處理2)的UV-B輻照，每天4 h，以不輻照為對(duì)照。照射后4 d，8 d，12 d和16 d，取鐵皮石斛苗葉片測(cè)定葉片光合色素含量、類黃酮含量與PAL酶活性，每處理重復(fù)3次。UV-B輻照在組培條件下進(jìn)行。

1.3 測(cè)定方法

光合色素含量的測(cè)定按照Aron[7]的方法，略作修改，取新鮮的鐵皮石斛葉片0.1 g，加入5 mL純丙酮和少量石英砂，研磨成勻漿，用5 mL 80%的丙酮沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管中，于6 000 r/min離心10 min，分別測(cè)定663 nm、645 nm和470 nm處的吸光值。類黃酮含量的測(cè)定在Day[8]的方法上略作修改，取新鮮的鐵皮石斛葉片0.2 g，用10 mL酸化甲醇(甲醇∶水∶鹽酸=79∶20∶1)在4℃下浸提24 h，取上清液測(cè)300 nm處的吸光度值。PAL酶活性參考薛應(yīng)龍[9]的方法，并加以改進(jìn)，取新鮮的鐵皮石斛葉片0.2 g，加5 mL 0.1 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液(內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA和0.1 g PVP)低溫研磨，于10 000 r/min冷凍離心20 min；1 mL酶液+1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸+2 mL PBS，空白對(duì)照不加底物，代之1 mL硼酸緩沖液，置40℃水浴30 min，紫外分光光度計(jì)在290 nm處吸收測(cè)定，在290 nm處以每1 h吸收0.01(OD)所需酶量為1個(gè)活性單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛葉片的光合色素

1) 葉綠素a含量。由圖1可知，在UV-B輻射處理16 d內(nèi)，輻照強(qiáng)度為5.1 μW/cm2(處理1)和15.6 μW/cm2(處理2)的葉綠素a含量均低于CK。照射初期，葉綠素a含量變化呈升高趨勢(shì)，但上升幅度小于CK；照射后期，處理1的葉綠素a含量變化幅度不大，而處理2的則呈急劇下降趨勢(shì)。照射第16天時(shí)，處理1的葉綠素a含量是CK組的92%，而處理2的葉綠素a含量只是CK組的65%，說(shuō)明，由于長(zhǎng)時(shí)間UV-B輻射，植物細(xì)胞已受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致葉綠素a合成受阻。

2) 葉綠素b含量。圖1表明，在UV-B輻射處理16 d內(nèi)，處理1和處理2的葉綠素b含量均低于CK，這與葉綠素a含量變化趨勢(shì)大體一致。照射第16天時(shí)，處理1的葉綠素b含量是CK組的91%，而處理2的葉綠素b含量只是CK組的43%。

3) 類胡蘿卜素含量。由圖1看出，在照射初期，處理1和處理2的類胡蘿卜素含量高于CK，且處理2的類胡蘿卜素含量高于處理1的；照射后期，處理1的類胡蘿卜素含量變化呈緩緩下降趨勢(shì)，但含量始終高于CK，而處理2則呈急劇下降趨勢(shì)，最終導(dǎo)致含量低于CK組。照射第16天時(shí)，處理1的類胡蘿卜素含量是CK的140%，而處理2的類胡蘿卜素含量只是CK組的85%。說(shuō)明，一定劑量一定時(shí)間的UV-B輻射能誘導(dǎo)鐵皮石斛類胡蘿卜素的合成，含量增加，而高強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間的UV-B輻射使類胡蘿卜素合成受阻。

圖1 UV-B輻射后鐵皮石斛葉片的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量

Fig.1 Contents of chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoid inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

2.2 鐵皮石斛葉片的類黃酮含量

從圖2看出，在照射初期，UV-B輻射處理的類黃酮含量高于CK，且處理1和處理2在第8天達(dá)到最大值，處理1>處理2；照射后期，處理1的類黃酮含量變化呈緩緩下降趨勢(shì)，但含量始終高于CK，而且處理2呈急劇下降趨勢(shì)，最終導(dǎo)致含量低于CK；照射第16天時(shí)，處理1的類黃酮含量是CK的140%，而處理2的類黃酮含量只是CK的82%。說(shuō)明，在UV-B照射下，處理1鐵皮石斛合成較多的類黃酮，能有效吸收低強(qiáng)度的UV-B輻射，減輕UV-B輻射對(duì)植物的傷害；而處理2鐵皮石斛遭高強(qiáng)度UV-B輻射，造成不可逆的傷害，使其含量急劇降低。

圖2 UV-B輻射后鐵皮石斛葉片的類黃酮含量

Fig.2 Flavonoids content inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

圖3 UV-B輻射后鐵皮石斛葉片的PAL酶活性

Fig.3 PAL activity inD.officinaleseedling leaves under UV-B radiation

2.3 PAL酶活性

從圖3可知，照射初期，PAL酶活性處理1>處理2，兩者均高于CK，且在第8天達(dá)最大值；照射后期，處理1的PAL酶活性變化呈緩緩下降趨勢(shì)，但活性始終高于CK，而處理2呈急劇下降趨勢(shì)，最終低于CK。照射第16天時(shí)，處理1的PAL酶活性是CK的147%，而處理2是CK的63%。說(shuō)明，UV-B輻射強(qiáng)度較大以及長(zhǎng)時(shí)間輻射可能造成鐵皮石斛葉片細(xì)胞破壞。

3 結(jié)論與討論

1) UV-B輻射對(duì)許多植物都有不同程度的影響。葉綠素含量已經(jīng)被認(rèn)為是衡量植物受UV-B輻射傷害及植物抗性的重要指標(biāo)[4]。本研究表明，UV-B照射后，鐵皮石斛葉綠素a或葉綠素b含量均低于CK，這與前人的研究結(jié)果相一致[10-14]。然而，在UV-B照射初期，葉綠素a和葉綠素b的含量變化呈上升趨勢(shì)，上升幅度較小，這可能是因?yàn)殍F皮石斛在受到UV-B照射后，啟動(dòng)了生理防御機(jī)制，如增加類胡蘿卜素和類黃酮含量，使葉綠素含量不至受到嚴(yán)重的抑制或破壞。另外，照射12 d后，高強(qiáng)度輻射的葉綠素a和葉綠素b含量變化呈急劇下降趨勢(shì)，而低強(qiáng)度輻射的組呈緩緩下降趨勢(shì)。這可能是由于UV-B輻射強(qiáng)度較大以及長(zhǎng)時(shí)間輻射使鐵皮石斛自身的生理防御機(jī)制受到破壞，無(wú)法保護(hù)自身細(xì)胞正常運(yùn)行。

2) 類胡蘿卜素不僅能拓寬光合作用中的吸收光譜并將吸收的光能傳遞給葉綠素，而且能通過(guò)散失高光強(qiáng)下多余能量來(lái)保護(hù)葉綠素[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，UV-B照射初期提高了類胡蘿卜素含量，與郭巍等[16]在水稻上的試驗(yàn)和牛傳坡等[17]在冬小麥上的試驗(yàn)得到結(jié)論一致。隨著輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，高強(qiáng)度UV-B輻射類胡蘿卜素含量急劇降低(含量低于CK組)，與魏曉雪[18]在紅松幼苗得到的研究結(jié)論一致。說(shuō)明，鐵皮石斛在高強(qiáng)度UV-B輻射下，葉片細(xì)胞遭到破壞。

3) 類黃酮是植物抵御UV-B輻射的一種有效物質(zhì)，其能吸收(或過(guò)濾)進(jìn)入葉片內(nèi)的部分紫外光子，減少進(jìn)入細(xì)胞的UV-B輻射，減輕10%細(xì)胞受害[19]。在UV-B照射初期，類黃酮含量高于CK，原因是UV-B照射誘導(dǎo)鐵皮石斛產(chǎn)生更多的類黃酮，緩解了UV-B輻射的傷害，與李元等[4]和方興等[20]提出在UV-B照射下，類黃酮含量提高的結(jié)論吻合。然而隨著輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，高強(qiáng)度UV-B輻射處理其類黃酮含量急劇降低,這與Kinnunen[21]在歐洲赤松針和董新純[22]在苦蕎所得到的研究結(jié)論相一致。研究還發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度的UV-B輻射類黃酮含量在UV-B照射第8天后緩緩降低，波動(dòng)幅度沒(méi)有高強(qiáng)度輻射的強(qiáng)烈，而且根據(jù)鐵皮石斛的生長(zhǎng)狀況，在處理后期，處理1的葉片稍微變紫，而處理2的植株已經(jīng)表現(xiàn)出不同程度的衰老跡象，如葉子變黃，這說(shuō)明鐵皮石斛可適應(yīng)低強(qiáng)度的UV-B輻射；而高強(qiáng)度UV-B輻射的處理對(duì)鐵皮石斛造成不可逆的傷害，這種傷害導(dǎo)致了細(xì)胞類黃酮降解加速而合成困難。

4) PAL酶作為植物許多重要次生代謝產(chǎn)物合成的起始酶[23-24]，具有重要的生理意義。研究發(fā)現(xiàn)，UV-B照射下，鐵皮石斛葉片PAL酶活性變化趨勢(shì)與類黃酮的大體一致。有研究表明，PAL酶活性和類黃酮含量之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系[25]。這可能是由于增強(qiáng)UV-B輻射誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng)，苯丙氨酸解氨酶作為植物類黃酮合成代謝的起始酶[24]，促進(jìn)了類黃酮的合成[26]，導(dǎo)致類黃酮含量的增加。

綜上所述，低強(qiáng)度UV-B輻射下，鐵皮石斛可以合成較多的類胡蘿卜素和類黃酮，抵抗UV-B輻射的傷害，從而使得葉片葉綠素含量變化較小。然而高強(qiáng)度UV-B輻射可能破壞了鐵皮石斛葉片細(xì)胞，植物無(wú)法合成紫外吸收物質(zhì)(如類黃酮)，從而導(dǎo)致葉片葉綠素含量急劇減少。

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(責(zé)任編輯： 聶克艷)

Effects of UV-B Radiation on Photosynthetic Pigments, Flavonoids and PAL Activity inDendrobiumofficinale

MO Yuncai, ZENG Lingjie*, HUANG Han, FENG Hongyao,YE Jingwei, LI Jingbiao, ZHOU Congran

(CollegeofMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510006,China)

To explore the effects of increasing UV-B radiation on physiological metabolism ofD.officinaleseedlings, the changes of contents of photosynthetic pigments, flavonoid as well as PAL activity inD.officinaleseedling leaf under two UV-B radiations, 5.1 W/cm2and 15.6 W/cm2, were studied. Results:Chlorophyll contents in leaf reduced under UV-B radiations, and with persistent radiation, 15.6 W/cm2group had a quicker drop than that in 5.1 W/cm2group. In addition, during the whole radiation, the contents of carotenoid, flavonoid as well as PAL activity in 5.1 W/cm2group were higher than those in CK group; Meanwhile, 15.6 W/cm2group arrived at a peak on 8thday, then dropped rapidly.Analysis indicated that under low-intensity UV-B radiation,D.officinalecould be defended due to UV protection substance like carotenoid and flavonoid, while damaged under high-intensity UV-B radiation.

Dendrobiumofficinale; UV-B radiation; photosynthetic pigment; flavonoids; PAL

2015-01-31； 2015-06-27修回

廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目“鐵皮石斛種質(zhì)資源的UV-B篩選與良種培育基地建設(shè)”(2012A030100012)

莫運(yùn)才(1991-)，男，在讀碩士，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail:1210309308@qq.com

*通訊作者：曾令杰(1970-)，男，教授，博士，從事中藥材GAP種植與中藥質(zhì)量研究。E-mail:zlj334477@aliyun.com

1001-3601(2015)07-0355-0034-04

S567.23+9

A