劉宇軒，鄭君堯，張文瓊，黃代新，*

（1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院法醫(yī)學系，武漢 430030；2. 隨縣公安局，湖北 隨州 441300；3. 老河口市公安局，湖北 老河口 441800）

·綜 述·

法醫(yī)降解生物檢材DNA分型研究進展

劉宇軒1，2，鄭君堯3，張文瓊1，黃代新1，*

（1. 華中科技大學同濟醫(yī)學院法醫(yī)學系，武漢 430030；2. 隨縣公安局，湖北 隨州 441300；3. 老河口市公安局，湖北 老河口 441800）

生物檢材會受到各種內(nèi)外因素的影響，DNA通過酶解、氧化、水解、輻射等機 制降解，導致STR分型出現(xiàn)Ladder-like條帶、Su tter峰、等位基因不平衡擴增及 丟失、PCR編碼錯誤等等。國內(nèi)外學者就降解生物檢材進行了大量研究，主要是縮短擴增片段長度，提高降解生物檢材分型成功率，開發(fā)出miniSTR， SNP 和InDels等試劑盒。一些學者關(guān)注PCR前處理技術(shù)，如大片段回收技術(shù)，利用DNA修復(fù)酶修復(fù)損傷DNA的DNA修復(fù)技術(shù)等。還有學者關(guān)注PCR后純化技術(shù)。隨著科技的進步，一些新的技術(shù)如下一代測序技術(shù)、全基因擴增技術(shù)也被用來處理降解DNA樣本。本文就DNA降解機制、降解DNA對分型的影響、降解DNA定量及分型檢測等方面的進展作一簡要綜述。

法醫(yī)物證學；降解生物檢材；DNA分型

法醫(yī)學實踐中，常會遇到各種各樣的腐敗、降解生物檢材，此類生物檢材的DNA分型一直是困擾法醫(yī)學界的難題之一。對此，國內(nèi)外學者就降解生物檢材的DNA分型檢驗進行了大量研究。本文就DNA降解機制、降解DNA對分型的影響、降解DNA定量及分型檢測等方面的進展進行簡要介紹。

1 DNA降解機制

細胞死亡后，內(nèi)源性核酸酶首先參與到DNA降解過程中，在其作用下，DNA逐步降解。同時，細胞質(zhì)中的溶酶體破裂后，釋放出各種水解酶類，如組織蛋白水解酶等，消化染色體上的組蛋白，加速內(nèi)源性核酸酶對DNA的降解。細胞膜破裂后，釋放出營養(yǎng)豐富的細胞液，促進微生物的生長，微生物分泌的消化酶，導致DNA雙鏈斷裂、降解。此外，非酶依賴的水解、氧化、輻射、紫外等損傷能對DNA造成氧化損傷、單雙鏈斷裂、堿基改變、DNA鏈交聯(lián)、二聚體形成等多種損傷。

2 降解DNA對分型的影響

2.1 Ladder-like條帶

對嚴重降解的檢材進行STR分型時，可形成Ladder-like條帶。Ivanov等［1］在對車臣戰(zhàn)爭中死亡士兵的遺骸進行檢測時，發(fā)現(xiàn)許多樣本的STR分型出現(xiàn)Ladder-like條帶。通過堿處理人K562細胞株，人為控制DNA降解程度，當DNA長度降至160 bp以下時，即出現(xiàn)Ladder-like條帶干擾。

2.2 Sutter帶

Ivanov等［1］在對遺骸中降解程度重的肌肉分型時，發(fā)現(xiàn)vWA基因座主帶下方出現(xiàn)幾條較弱的次帶，而降解程度輕的牙齒和干皮沒有出現(xiàn)Stutter帶，提示檢材DNA的降解程度和出現(xiàn)Stutter帶的機率成正相關(guān)。目前對于降解檢材中易出現(xiàn)Stutter帶的原因，尚不清楚。

2.3 等位基因不平衡擴增及丟失

降解檢材進行STR分型時，含有雜合子的基因座易出現(xiàn)等位基因擴增不平衡，甚至等位基因丟失，致使將雜合子誤判為純合子。其原因可能為降解檢材中，兩等位基因拷貝數(shù)不同，導致各等位基因擴增效率差別。加之不同產(chǎn)物變性和退火溫度不同，不平衡擴增現(xiàn)象將更為明顯［2］。

2.4 PCR編碼錯誤

降解DNA在PCR延伸階段容易造成堿基摻入錯誤。摻入錯誤的原 因與聚合酶特性、降解檢材堿基改變有關(guān)。Taq聚合酶錯誤摻入率在2×104左右，然而在改變擴增條件及模板序列的條件下，其錯誤率可以提升10倍以上［3］。PCR早期循環(huán)的編碼錯誤會在后期循環(huán)中被放大，導致DNA序列錯誤。使用高保真聚合酶可以減少此 類現(xiàn)象的發(fā)生。此外，DNA的水解反應(yīng)能將胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、分別轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?、胸腺嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤，導致PCR編碼錯誤。由于PCR-STRs是基于DNA片 段長度進行分型，故PCR編碼錯誤對結(jié)果的影響不大［3］。

3 降解DNA的定量

常規(guī)的斑點雜交及紫外定量法等都不能確定D NA的降解程度。實時定量PCR技術(shù)設(shè)計2組引物對不同長度的DNA片段進行擴增，通過比較兩片段被擴增的比例，可預(yù)測DNA的降解程度［4，5］。還可在系統(tǒng)中添加PCR內(nèi)對照（internal PCR control， IPR）DNA片段［6］或男性特有的SRY基因組［7］，不但能分析核DNA的降解程度及抑制劑情況，還能在高濃度女性DNA背景中檢測到微量的男性DNA樣本。

4 降解DNA檢測方法

4.1 大片段DNA回收

在降解DNA中，由于小片斷DNA過多，而大片段相對較少，擴增時小片段DNA被優(yōu)勢擴增，導致大片段分型失?。?］。因此，如何提高大片段在模板DNA中的比例就成為關(guān)注的焦點［9，10］。Wang等［9］利用磁珠雜交技術(shù)，設(shè)計僅與含大片段STR的DNA片段結(jié)合的探針，雜交后與磁珠結(jié)合，洗去未結(jié)合的DNA片段及其它成分，回收后的DNA經(jīng)復(fù)合擴增體系檢測，大片段STR基因座得以成功分型。

4.2 DNA修復(fù)

對損傷DNA進行修復(fù)以提高分型成功率的研究日益受到關(guān)注。Pusch等［11］嘗試運用大腸桿菌DNA聚合酶I和T4 DNA連接酶修復(fù)大約公元450~700年間的骨骼樣本，取得了較好的效果。后來，Kovatsi等［12］同樣應(yīng)用DNA聚合酶I和T4 DNA連接酶對公元前1700~2100年的10枚牙齒DNA進行修復(fù)，成功從其中8枚擴增出性別基因。Bonin等［13，14］利用Taq DNA聚合酶修復(fù)甲醛及Bouin氏液固定組織DNA，然后擴增長度不同的基因座，各基因座檢出率較未修復(fù)DNA有不同程度提高。本文作者利用Taq DNA聚合酶修復(fù)普通甲醛及中性甲醛固定組織DNA，在修復(fù)過程中引入PCR循環(huán)參 數(shù)，使大量DNA短片段以長片段為模板，經(jīng)過模擬PCR循環(huán)，得以放大性延伸，復(fù)合STR擴增等位基因檢出率較未修復(fù)DNA有較大提高。雙鏈斷裂是降解檢材DNA損傷的主要類型，DNA修復(fù)更為困難。Battista［15］應(yīng)用RecA蛋白、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶，修復(fù)DNA雙鏈斷裂，能使約40%的DNA重新連接，為DNA修復(fù)提供了一種新的方法。目前商業(yè)化的修復(fù)試劑主要有PreCR? Repair Mix和Restorase?等［16］。

4.3 縮短擴增子

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證領(lǐng)域，常用的STR分型商品化試劑盒擴增片段長度多為100~450 bp。目前，提高降解DNA檢出率主要方法是縮短擴增片段長度，如miniSTR、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入/缺失多態(tài)性（insertions/ deletions，InDels）等。與常規(guī)STR相比，miniSTR盡管靈敏度較高，但受到擴增片段長度的限制，在一個復(fù)合擴增體系中只能同時擴增較少數(shù)量的基因座。此外，因miniSTR需重新設(shè)計引物，應(yīng)注意其分型結(jié)果與傳統(tǒng)STR分型的一致性。SNP擴增產(chǎn)物通常小于100 bp，更適合于降解DNA分型。大多數(shù)SNPs僅有2個等位基因，其鑒別能力有限，而三等位基因SNPs的鑒別能力相對較高。Westen等［17］研究了31個三等位基因SNPs組成的復(fù)合擴增系統(tǒng)，能有效檢驗降解DNA，還能檢出比例為8：1的混合檢材。核小體中組蛋白和DNA復(fù)合物能阻止DNA降解，組蛋白和DNA復(fù)合物通常能保護147 bp的DNA序列［18］。Freire-Arada等［19］篩選出靠近核小體中部的18個SNPs位點，組成復(fù)合擴增體系，其檢測降解檢材的靈敏度比普通SNPs復(fù)合體系高6%，且明顯高于miniSTRs。Thanakiatkrai等［20］對60個STR基因座分析后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)STR 基因座的DNA序列都傾向于與核小體結(jié)合成一個整體，能較好地抵抗外界損傷，建議在選擇遺傳標記時盡量選擇那些可以受到保護的基因座。InDel作為一種特殊類型的二等位基因標記，兼具SNP和STR的特征，擴增產(chǎn)物大小靈活可變，且能夠兼容毛細管電泳平臺，是降解生物檢材分型的另一個較好選擇［21］。

4.4 線粒體DNA測序

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）因具有拷貝數(shù)多、環(huán)狀結(jié)構(gòu)抗腐敗能力強的特點，尤其適用于降解生物檢材的DNA分型。因此，當常規(guī)STR、miniSTR、SNP等分型失敗時，mtDNA檢測不失為一個較好的選擇。但mtDNA為母系遺傳，其意義僅在于排除，加之mtDNA具有異質(zhì)性，對結(jié)果的解釋造成不利影響。

4.5 全基因擴增

全基因組擴增（whole genome amplification， WGA）是一種對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術(shù)，可在沒有序列傾向性、高準確度的前提下大幅度增加DNA的總量，并能以其擴增產(chǎn)物作為模板，進行后續(xù)分析。WGA技術(shù)已被眾多研究者嘗試應(yīng)用于多種降解樣本的檢測。Giardina等［22］聯(lián)合應(yīng)用多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）和SNPs檢測人工降解DNA，未經(jīng)MDA步驟的降解DNA至少有4%位點分型失敗，而經(jīng)MDA步驟的降解DNA全部分型成功。Wang等［23］介紹了一種稱之為RCA-RCA（restriction and circularization-aided rolling circle amplification）的技術(shù)，該技術(shù)能成功擴增福爾馬林固定組織DNA，使其放大數(shù)千倍，且微衛(wèi)星測試表明擴增后的DNA與原始DNA一致。Maciejewska等［24］系統(tǒng)比較了7種WGA方法，降解檢材及非降解檢材經(jīng)WGA擴增后，DNA產(chǎn)量最高的方法為RCA-RCA法，最低為PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）法。STR分型方面，非降解檢材分型以GenomiPhi試劑盒和PEP-PCR法最好，降解檢材分型以GenomePlex試劑盒最好，可以擴增長度為100 bp的片段。值得注意的是，WGA技術(shù)聯(lián)合STR檢驗常會出現(xiàn)等位基因不均衡擴增、等位基因丟失或插入、stutter峰等現(xiàn)象，影響分型結(jié)果的判讀。

4.6 電泳前純化

除了上述方法，可以在電泳前對擴增后產(chǎn)物進行純化，以去除未結(jié)合的引物、dNTP、鹽等成分，增加PCR產(chǎn)物進入毛細管的數(shù)量。Westen等［25］應(yīng)用下一代測序技術(shù)中的PCR片段篩選和純化技術(shù)回收PCR后產(chǎn)物，此技術(shù)通過調(diào)整PCR產(chǎn)物和磁珠的比例，可回收不同大小的DNA片段。通過純化回收，大片段產(chǎn)物峰高可增加3~4倍，而小片段卻不增加。豐蕾等［26］應(yīng)用分子篩、超濾膜、親和層析等方法純化PCR后產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)純化PCR產(chǎn)物可以增強STR分型峰強度約4倍，同時增加等位基因檢出率。但PCR產(chǎn)物純化后不會改善雜合子峰高不平衡現(xiàn)象。

4.7 其他方法

許多學者對其他方法進行了嘗試，如巢式PCR （nest PCR）［27］、寡核苷酸連接檢測（oligonucleotide ligation assay， OLA）［28］、直接多重測序（direct multiplex sequencing， DMPS）［29］、基于連接酶反應(yīng)的PCR（ligase detection reaction-PCR，LDR-PCR）［30］等。如Strom 等［27］運用巢式PCR技術(shù)成功鑒別燒焦人體組織的性別。Zhang等［30］利用LDR-PCR方法，準確得到片段長度小于100 bp的高度降解DNA SNPs基因座分型，并可進行4個基因座復(fù)合分型檢測。

5 展 望

綜上所述，對于降解DNA的分型，可利用實時定量PCR技術(shù)對其降解程度做出判斷，以選擇合適的遺傳標記系統(tǒng)。miniSTR以其高度多態(tài)性，可與現(xiàn)有商品化試劑盒的STR兼容，可利用現(xiàn)有DNA數(shù)據(jù)庫，且具有操作簡單、低成本等優(yōu)點，成為降解DNA分型檢驗的首選。隨著SNP研究的深入，開發(fā)更適用于降解DNA分型檢驗的SNP位點，完善SNP數(shù)據(jù)庫，其必將在降解DNA分型檢驗中扮演越來越重要的角色。此外，一些應(yīng)用于法醫(yī)學的新技術(shù)，如大片段篩選、DNA修復(fù)、全基因擴增、下一代測序技術(shù)［31］等的發(fā)展，也將為降解DNA分型檢驗開辟新的途徑。

［1］ Ivanow PL， Isaenko MV. Identifi cation of human decompo sed remains using the STR system： Effect on typing results. Second European Symposiumon Human Identifi cation-Promega Corp，1998.

［2］ Walsh PS， Erlich HA， Higuchi R. Preferential PCR amplifi cation of alleles： Mechanisms and solutions. PCR Methods Appl，1992，1（4）：241-250.

［3］ Eckert KA， Kunkel TA. DNA polymerase fi delity and the polymerase chain reaction. PCR Methods Appl， 1991，1（1）：17-24.

［4］ Smith BC， Vandegrift E， Fuller VM， et al. Evaluation of degradation in DNA from males with a quantitative gender typing，endpoint PCR multiplex. J Forensic Sci， 2015，60（2）：399-408.

［5］ Pineda GM， Montgomery AH， Thompson R， et al. Development and validation of InnoQuant?， a sensitive human DNA quantitation and degradation assessment method for forensic samples using high copy number mobile elements Alu and SVA. Forensic Sci Int Genet， 2014，13：224-35.

［6］ Swango KL， Timken MD， Chong MD， et al. A quantitative PCR assay for the assessment of DNA degrad ation in forensic samples. Forensic Sci Int， 2006，158（1）：14-26.

［7］ Hughes-Stamm SR， Ashton KJ， van Daal A. Assessment of DNA degradation and the genotyping success of highly degraded samples. Int J Legal Med， 2011，125（3）：341-348.

［8］ 倪星群，郭景元，陳麗嫻，等. 降解DNA的PCR分型-電洗脫回收大片斷DNA法. 法醫(yī)學雜志， 1996，12（4）：211-212.

［9］ Wang J， McCord B. The application of magnetic bead hybridization for the recovery and STR amplifi cation of degraded and inhibited forensic DNA. Electrophoresis， 2011，32（13）：1631-1638.

［10］ Gadipally SR， Sarkar A， Nandineni MR. Selective enrichment of STRs for applications in forensic human identification. Electrophoresis， 2015，36（15）：1768-1774.

［11］ Pusch CM， Giddings I， Scholz M. Repair of degraded duplex DNA from prehistoric samples using Escherichia coli DNA polymerase I and T4 DNA ligase. Nucleic Acids Res，1998，26（3）：857-859.

［12］ Kovatsi L， Nikou D， Triantaphyllou S， et al. DNA repair enables sex identifi cation in genetic material from human teeth. Hippokratia， 2009，13（3）：165-168.

［13］ B onin S， Petrera F， Niccolini B， et al. PCR analysis in archival postmortem tissues. Mol Pathol， 2003，56（3）：184-186.

［14］ Bonin S， Petrera F， Rosai J， et al. DNA and RNA obtained from Bouin’s fi xed tissues. J Clin Pathol， 2005，58（3）：313-316.

［15］ Battista JR. Tools for improving the quality of aged， degraded， damaged， or otherwise compromised DNA evidence. （2012）. ［2011-07-10］. http：//www.ncjrs.gov/pdffiles1/nij/ grants/237840.pdf.

［16］ Robertson JM， Dineen SM， Scott KA， et al. Assessing Pre-CR? repair enzymes for restoration of STR profiles from artifi cially degraded DNA for human identifi cation. Forensic Sci Int Genet， 2014，12：168-180.

［17］ Westen AA， Matai AS， Laros JF， et al. Tri-allelic SNP markers enable analysis of mixed and degraded DNA samples. Forensic Sci Int Genet， 2009，3（4）：233-241.

［18］ Richmond TJ， Davey CA. The structure of DNA in the nucleosome core. Nature， 2003，423（6936）：145-150.

［19］ Freire-Aradas A， Fondevila M， Kriegel AK， et al. A new SNP assay for identifi cation of highly degraded human DNA. Forensic Sci Int Genet， 2012，6（3）：341-349.

［20］ Thanakiatkrai P， Welch L. Evaluation of nucleosome forming potentials （NFPs） of forensically important STRs. Forensic Sci Int Genet， 2011，5（4）：285-290.

［21］ Santos VR， Pena HB， Pena SD. A multiplex panel of shortamplicon insertion-deletion DNA polymorphisms for forensic analysis. Genet Mol Res， 2015，14（2）：2947-52.

［22］ Giardina E， Pietrangeli I， Martone C， et al. Whole genome amplifi cation and real-time PCR in forensic casework. BMC Genomics， 2009，10：159.

［23］ Wang G， Maher E， Brennan C， et al. DNA amplifi cation method tolerant to sample degradation. Genome Res， 2004，14（11）：2357-2366.

［24］ Maciejewska A， Jakubowska J， Paw?owski R. Whole genome amplifi cation of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes. Int J Legal Med， 2013，127（2）：309-319.

［25］ Westen AA， van der Gaag KJ， de Knijff P， et al. Improved analysis of long STR amplicons from degraded single source and mixed DNA. Int J Legal Med， 2013，127（4）：741-747.

［26］ 豐蕾，凃政，石屹，等. PCR產(chǎn)物純化增強STR分型強度的研究. 刑事技術(shù)， 2014（6）：11-13.

［27］ Strom CM， RechitskyS. Use of nested PCR to identify charred human remains and minute amounts of blood. J Forensic Sci，1998，43（3）：696-700.

［28］ Ballantyne J. Double strand break repair of highly damaged DNA. （2011）. ［2011-06-22］. http：//www.ncjrs.gov/pdffiles1/ nij/grants/236690.pdf.

［29］ Stiller M， Knapp M， Stenzel U， et al. Direct multiplex sequencing （DMPS）—a novel method for targeted high-throughput sequencing of ancient and highly degraded DNA. Genome Res，19（10）：1843-1848.

［30］ Zhang Z， Wang BJ， Guan HY， et al. A LDR-PCR approach for multiplex polymorphisms genotyping of severely degraded DNA with fragment sizes ＜100 bp. J Forensic Sci，2009，54（6）：1304-1309.

［31］ Templeton JE， Brotherton PM， Llamas B， et al. DNA capture and next-generation sequencing can recover whole mitochondrial genomes from highly degraded samples for human identifi cation. Investig Genet， 2013，4（1）：26.

Research Progress on Genotyping Degraded Biological Samples

LIU Yuxuan1，2， ZHENG Junyao3， ZHANG Wenqiong1， HUANG Daixin1，*
（1. Department of Forensic Medicine， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China； 2. Public Security Bureau of Sui County， Hubei Suizhou 441300， China； 3. Public Security Bureau of Laohekou City， Hubei Laohekou 441800，China ）

Human biological specimens collected from crime scenes are usually affected by internal and environmental factors， such as heat， humidity， UV light and enzymes. Under these circumstances， DNA is usually damaged from enzymatic degradation， oxidation， hydrolysis or radiation， resulting in a variety of undesired occurrence for profi le interpretation like ladder-like pattern， stutter peak， heterozygote peak imbalance or allelic drop-out and PCR miscoding lesions. To cope with this diffi culty， numerous strategies have been devised to tac kle these problems. The most important strategies aiming at shorter siz ed amplicons， were used to increase the effi ciency to type degraded DNA. Presently， forensic kits comprising of mini-STRs，SNPs and InDels are increasingly developed and established for routine case work. Besides， some researchers have developed pre-amplifi cation large fragment recovery methods or DNA repair technology to mend the damaged DNA with assistance of relevant enzymes. Oth ers focused on post-PCR purifi cation protocol to enhance the DNA genotyping rate. In addition， some novel technologies， for example， next-generation sequencing and whole genome amplifi cation， are used to deal with DNA-degraded samples. In this paper， we discuss the mechanisms of DNA degradation and their impact on genotyping， and describe the progress on the quantifi cation of degraded DNA together with the methods for genotyping and other aspects.

forensic biological evidence； degraded biological samples； DNA typing

DF795.2

A

1008-3650（2015）06-0489-04

10.16467/j.1008-3650.2015.06.013

2015-01-07

劉宇軒，法醫(yī)師，碩士研究生，研究方向為法醫(yī)遺傳學。 E-mail： 313568627@qq.com

黃代新，教授，博士生導師，博士，研究方向為法醫(yī)遺傳學。 E-mail： huangdaixin@mails.tjmu.edu.cn

引用本文格式： 劉宇軒， 鄭君堯， 張文瓊， 等. 法醫(yī)降解生物檢材DNA分型研究進展. 刑事技術(shù)，2015，40（6）：489-492.