周 昆，畢亞男，史 紅

（天津中醫(yī)藥大學1．中醫(yī)藥研究院、2．方劑學教育部重點實驗室，天津 300193）

異補骨脂素抑制MRP2、MRP3所致的HepG2細胞內膽汁酸蓄積和毒性

周 昆1，2，畢亞男1，史 紅1，2

（天津中醫(yī)藥大學1．中醫(yī)藥研究院、2．方劑學教育部重點實驗室，天津 300193）

中國圖書分類號：R284．1；R322．47；R329．24；R575

摘要：目的 觀察異補骨脂素體外對HepG2細胞毒性和細胞內膽汁酸濃度的影響，并考察其對膽汁酸合成轉運的影響。方法 不同濃度異補骨脂素在HepG2細胞作用24 h，MTT法檢測細胞存活，并檢查細胞內膽汁酸濃度。常規(guī)TRIzol法提取RNA，real time PCR檢測細胞中轉運體BSEP、MRP2、MRP3、OATP2、NTCP、OSTα，合成酶CYP7A1、CYP27A1和受體FXR、PXR的mRNA轉錄水平。結果

HepG2細胞存活率隨著異補骨脂素濃度升高而劑量依賴性的降低，異補骨脂素作用24 h的IC50為118．1 μmol·L－1。100、400 μmol·L－1異補骨脂素可使細胞內膽汁酸濃度明顯升高。異補骨脂素在25 μmol·L－1時就可使MRP2、MRP3、CYP7A1明顯降低，當濃度增大到100 μmol·L－1時，OATP2、OSTα、CYP27A1、FXR、PXR也明顯升高，但BSEP、NTCP差異無顯著性。結論 異補骨脂素可引起HepG2細胞內膽汁酸升高和細胞毒性，其機制可能與抑制MRP2、MRP3有關。

關鍵詞：異補骨脂素；膽汁酸；細胞毒性；膽汁酸合成；膽汁酸轉運；HepG2細胞；MRP2；MRP3

網絡出版時間：2015－7－22 10：42 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．020．html

異補骨脂素是一種呋喃香豆素類成分，存在于補骨脂等多種藥材中，2010藥典中將異補骨脂素及其同分異構體補骨脂素作為藥材補骨脂（Psoralea corylifolia L．）的質量控制成分。補骨脂可用于治療更年期綜合征、骨質疏松等，其中異補骨脂素有雌激素樣作用［1］，可選擇性作用于雌激素受體α［2］，可以促進成骨細胞分化成熟［3］，有利于骨質疏松的治療，是補骨脂中一種有效成分。近年來發(fā)現(xiàn)臨床中補骨脂及其相關制劑可能導致肝損害，并有膽汁淤積的表現(xiàn)［4－5］，而動物實驗發(fā)現(xiàn)異補骨脂素、補骨脂素、異補骨脂苷、補骨脂苷為主要成分的補骨脂水提物有明顯肝毒性［6］，更有研究表明異補骨脂素和補骨脂素對小鼠肝功能有一定影響［7］，這提示補骨脂導致的膽汁淤積性肝損害現(xiàn)象可能與異補骨脂素和補骨脂素有關。更進一步推測就是異補骨脂素和補骨脂素干擾了膽汁酸的正常合成轉運，從而導致膽汁淤積的發(fā)生。通常認為膽汁酸是膽固醇在肝細胞內經由CYP7A1（7-α羥化酶，cytochrome P450，fam-ily 7，subfamily A，polypeptide 1）、CYP27A1（甾醇27-羥化酶，cytochrome P450，family27，subfamily A，polypeptide 1）等酶合成［8］，而BSEP（膽鹽輸出泵，也稱為ABCB11，ATP-binding cassette，sub-family B，member 11）、MRP2（多藥耐藥相關蛋白2，也稱為ABCC2，ATP-binding cassette，sub-family C，member 2）、MRP3（多藥耐藥相關蛋白3，也稱為ABCC3，ATP-binding cassette，sub-family C，member 3）、OATP2（有機陰離子轉運多肽2，也稱為OATP1B1，SLCO1B1，solute carrier organic anion transporter family，member 1B1）、OSTα（有機溶質轉運蛋白α，也稱為SLC51A，solute carrier family 51，alpha subunit）、NTCP（鈉－?；悄懰峁厕D運蛋白，也稱為SLC10A1，solute carrier family 10，member 1）是肝細胞膜上的與膽汁酸轉運相關的轉運體，這些酶和轉運體在膽汁酸的合成轉運中起到重要的作用，并且肝細胞內存在FXR（法尼醇X受體，farne-soid X receptor）、PXR（孕烷X受體，pregnane X re-ceptor）等受體可以調節(jié)相關酶和轉運體［9－10］。本研究考察了異補骨脂素作用24 h后HepG2細胞中相關酶、轉運體等mRNA的變化，以了解異補骨脂素對于膽汁酸合成轉運的影響，為解釋異補骨脂素在膽汁酸淤積中的作用機制、以及更進一步地闡明補骨脂毒性提供基礎。

1　材料

1．1受試藥 異補骨脂素購自天津市月牙湖科技有限公司，經HPLC檢測純度大于95%。

1．2細胞 HepG2細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1．3試劑與儀器 DMEM培基和無血清Opti-MEM培基，胎牛血清（FBS）為Gibco產品；青霉素－鏈霉素雙抗、胰酶、DMSO、DEPC水為北京索萊寶產品；PBS為武漢博士德產品；TRIzol為Invitrogen產品；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為Fermen-tas產品；Hot start fluo-PCR mix SYBR GreenⅠ（2×）為上海生工產品；BCA蛋白檢測試劑盒為Ther-mo產品；總膽汁酸（TBA）試劑盒為中生北控產品；其它化學試劑為國產分析純。

Hitachi 7020全自動生化儀；PerkinElmer En-spire多功能讀板機；Thermo Stratos離心機；Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀；Olympus BX51型倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)；上海世平SPH-103B恒溫振蕩器。

2　方法

2．1細胞培養(yǎng) HepG2細胞培養(yǎng)于含10%的FBS、1%雙抗的DMEM的培基中，置37℃、5%CO2的孵箱中進行培養(yǎng)。細胞貼壁24 h，每48 h換液1次，先用無菌PBS洗細胞3次，再加0．25%的胰酶消化。細胞懸液離心（1 000 r·min－1，4℃，10 min）后棄上清，加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，反復吹打細胞至單細胞懸液，進行傳代和種板。

2．2細胞活力和細胞中膽汁酸檢測 HepG2細胞按每孔1×104個細胞接種于96孔板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h貼壁后，分別給予用Opti-MEM培基稀釋的終濃度為6.25、25、100、400 μmol ·L－1的異補骨脂素，作用24 h后移除培養(yǎng)基，加10 μL MTT溶液（5 g·L－1）溫箱孵育4 h，移除上清，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min后在490 nm處測得吸光度值。計算細胞存活率（相對于對照組）。

HepG2細胞按每孔1×105個接種于24孔板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h貼壁后，分別給予用Opti-MEM培基稀釋的終濃度為6．25、25、100、400 μmol·L－1的異補骨脂素，作用24 h后移除培養(yǎng)基，加入PBS緩沖液100 μL，用細胞刮刀刮取細胞，細胞用超聲破碎細胞，BCA法檢測細胞破碎液的蛋白濃度，并在全自動生化儀檢測TBA。

2．3Real time PCR檢測 HepG2細胞按每孔5× 105個接種于6孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后給予異補骨脂素（25、100 μmol·L－1，Opti-MEM培基稀釋）處理24 h。去除培養(yǎng)液，用PBS洗細胞3次。用TRIzol常規(guī)提取HepG2細胞中總RNA，－80℃保存。紫外分光光度法檢測RNA樣品的純度與濃度。按反轉錄試劑盒要求進行反轉錄，real time PCR反應體系20 μL，其中cDNA樣本1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Hot start Fluo-PCR mix試劑10 μL，無RNA酶水8 μL。在94℃預變性4 min，每個循環(huán)94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。取2－△△CT值進行數(shù)據統(tǒng)計。引物序列見下表：

Tab 1 Primer sequence of real time PCR

3　結果

3．1對HepG2細胞增殖及細胞內膽汁酸的影響異補骨脂素作用于HepG2細胞24 h，6.25 μmol· L－1異補骨脂素即對HepG2細胞增殖有一定抑制作用，細胞相對存活率為92.8%。在6.25～400 μmol ·L－1范圍內隨著異補骨脂素的濃度升高、細胞存活率也明顯降低，而400 μmol·L－1異補骨脂素作用下細胞相對存活率僅為27.9%。異補骨脂素作用24 h的IC50為118.1 μmol·L－1（95%可信限107.1 ～130.2 μmol·L－1），見Fig 1A。對細胞破碎液的檢測發(fā)現(xiàn)，異補骨脂素作用24 h后，400.0 μmol· L－1的異補骨脂素處理組HepG2細胞內膽汁酸濃度升高約5倍，100.0 μmol·L－1處理組的細胞內膽汁酸濃度也明顯升高，見Fig 1B。

3．2對膽汁酸合成轉運相關基因轉錄水平的影響異補骨脂素處理24 h后，HepG2細胞中BSEP、NTCP的mRNA雖然與空白相比均值有一定變化、但并無統(tǒng)計學意義；25 μmol·L－1異補骨脂素組，HepG2細胞中MRP2、MRP3、CYP7A1的mRNA轉錄均明顯降低，而100 μmol·L－1異補骨脂素組，除了MRP2、MRP3、CYP7A1的降低外，OATP2、OSTα、CYP27A1、FXR、PXR的mRNA轉錄明顯升高，見Fig 2，3。

Fig 1 Cell viability and bile acid concentration in HepG2 cells

4　討論

異補骨脂素在體外HepG2細胞中作用24 h的IC50為118.1 μmol·L－1，但其毒性作用的最小毒性劑量很小，按實驗結果可以擬合量效方程并計算IC5僅為3.8 μmol·L－1，提示異補骨脂素的安全劑量較低。

將細胞培養(yǎng)基中的藥物濃度近似為血液中的藥物濃度，可以借助于體內代謝研究結果來先對體外研究結果進行外推。大鼠代謝研究表明［11］，大鼠口服給予香豆素混合物（相當于異補骨脂素4.39 mg ·kg－1），異補骨脂素在血液中峰濃度高達37.89 mg·L－1，口服的生物利用度高達70.35%。同時有研究［12］表明異補骨脂苷在體內可以轉化為異補骨脂素，那么實際使用補骨脂時血液中異補骨脂素的來源除了異補骨脂素外還包括異補骨脂苷，這個量可達補骨脂的1%以上，按2010版藥典中補骨脂每人每天10 g的使用上限，折合大鼠異補骨脂素用量9 mg·kg－1。參考文獻［11］研究中的結果，大鼠血液中峰濃度可達70 mg·L－1以上（超過400 μmol· L－1，異補骨脂素分子質量186.16），即便是藥后24 h血液中異補骨脂素濃度也在2 mg·L－1以上（約10 μmol·L－1大于其在HepG2細胞的IC5）。很顯然，按上述推斷異補骨脂素在體內也會導致相似的毒性，這也許可以一定程度地解釋補骨脂所導致的肝損害。

Fig 2 Bile acid transporter mRNA transcription

膽汁酸可以誘導細胞凋亡［13］，高濃度的膽汁酸可導致動物肝損害［14－15］。Fig 4是異補骨脂素對膽汁酸調節(jié)相關基因影響的示意圖，F(xiàn)XR和PXR可以通過調節(jié)膽汁酸合成轉運來對抗膽汁酸的毒性，F(xiàn)XR和PXR的缺失會導致膽汁酸更容易蓄積而產生毒性作用［14］。理論上FXR的激活可以上調BSEP、OSTα／β、MRPs，下調NTCP以降低細胞內膽汁酸濃度，F(xiàn)XR還可下調CYP7A1以減少肝細胞內膽汁酸合成［8－9］。實驗中異補骨脂素100 μmol· L－1，細胞內膽汁酸濃度明顯升高，將會激活膽汁酸受體FXR、PXR，并使之上調，OSTα上調和CYP7A1下調是符合FXR預期作用的；而作為替代途徑的CYP27A1的上調可能是因為肝細胞內膽汁酸合成限速酶的CYP7A1被抑制的結果；通過文獻［15］發(fā)現(xiàn)，小鼠在膽酸的誘導下OATP2也是升高的，而且在膽酸的作用下小鼠的OATP2上調倍數(shù)明顯高于PXR－／－小鼠，盡管未用膽酸處理時野生型小鼠OATP2絕對水平低于PXR－／－小鼠肝臟中，但膽酸處理后OATP2水平反而高，提示實驗中OATP2似乎更可能是PXR的調節(jié)作用。異補骨脂素在25 μmol·L－1時，細胞內膽汁酸濃度已經有所升高，但與對照之間的差異尚無統(tǒng)計學意義，而此時MRP2、MRP3已經明顯下調，故異補骨脂素對MRP2、MRP3的下調作用顯然早于膽汁酸的淤積，是異補骨脂素對膽汁酸轉運干預的早期作用點，而上調的OATP2 和CYP27A1也許對抗了上調的OSTα和下調的CYP7A1的作用，最終導致膽汁酸在細胞內蓄積，細胞內膽汁酸的檢測也證實細胞內膽汁酸較正常升高了5倍、達到400 μmol·L－1。

Fig　3 Bile acid synthetase and receptor mRNA transcription

Fig 4 Effect of isopsoralen on bile acid synthesis and transport

當然，體外HepG2細胞是人源腫瘤細胞，而文獻［11－12］中代謝研究是大鼠的數(shù)據，種屬不同可能導致推論有一定差異，最終異補骨脂素在體內是否會同樣影響膽汁酸合成轉運還有待于研究確證。

參考文獻：

［1］ 趙丕文，牛建昭，王繼峰，等．異補骨脂素的植物雌激素作用及其機制的探討［J］．中國藥理學通報，2009，25（9）：1193－6．

［1］ Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，et al．Research on the phytoestro-genic effect and its mechanism of isopsoralen in T47D cells［J］．Chin Pharmacol Bull，2009，25（9）：1193－6．

［2］ Xin D，Wang H，Yang J，et al．2010．Phytoestrogens from Psora-lea corylifolia reveal estrogen receptor-subtype selectivity［J］．Phytomedicine，2010，17（2）：126－31．

［3］ 翟遠坤，潘亞磊，牛銀波，等．補骨脂素與異補骨脂素對乳鼠顱骨成骨細胞分化成熟影響的比較研究［J］．中國藥理學通報，2012，28（3）：355－61．

［3］ Zhai Y K，Pan Y L，Niu Y B，et al．Comparative studies on the differentiation and maturation of rat calvarial osteoblasts by psor-alen and isopsoralen in vitro［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28 （3）：355－61．

［4］ Nam S W，Baek J T，Lee D S，et al．A case of acute cholestatic hepatitis associated with the seeds of Psoralea corylifolia［J］．Clin Toxicol，2005，43（6）：589－91．

［5］ Cheung W I，Tse M L，Ngan T，et al．Liver injury associated with the use of Fructus Psoraleae（Bol-gol-zhee or Bu-gu-zhi）and its related proprietary medicine［J］．Clin Toxicol，2009，47（7）：683 －85．

［6］ 周 昆，代 志，柳占彪，等．補骨脂水提物引起的大鼠肝損害［J］．天津中醫(yī)藥大學學報，2013，32（4）：221－4．

［6］ Zhou K，Dai Z，Liu Z B，et al．Aqueous extract of psoralea coryl- ifolia induced liver injury in rats［J］．J Tianjin Univ Tradit Chin Med，2013，32（4）：221－4．

［7］ Wang X，Lou Y J，Wang M X，et al．Furocoumarins affect hepat-ic cytochrome P450 and renal organic ion transporters in mice［J］．Toxicol Lett，2012，209（1）：67－77．

［8］ Chiang J Y．Bile acids regulation of synthesis［J］．J Lipid Res，2009，50（10）1955－66．

［9］ Fiorucci S，Distrutti E，Ricci P，et al．Targeting FXR in cholesta-sis：hype or hope［J］．Expert Opin Ther Targets，2014，18（12）：1449－59．

［10］Pauli-Magnus C，Meier P J．Hepatobiliary transporters and druginduced cholestasis［J］．Hepatology，2006，44（4）：778－87．

［11］Feng L，Wang L，Jia X H．Pharmacokinetics，tissue distribution and excretion of Coumarin components from Psoralea corylifolia L．in rats［J］．Arch Pharm Res，2010，33（2）：225－30．

［12］Wang Y F，Liu Y N，Xiong W，et al．A UPLC-MS／MS method for in vivo and in vitro pharmacokinetic studies of psoralenoside，isop-soralenoside，psoralen and isopsoralen from Psoralea corylifolia ex-tract［J］．J Ethnopharmacol，2014，151（1）：609－17．

［13］Palmeira C M，Rolo A P．Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids［J］．Toxicology，2004，203（1－3）：1－15．

［14］Guo G L，Lambert G，Negishi M，et al．Complementary roles of farnesoid X receptor，pregnane X receptor，and constitutive andro-stane receptor in protection against bile acid toxicity［J］．J Biol Chem，2003，278（46）：45062－71．

［15］Teng S，Piquette-Miller M．Hepatoprotective role of PXR activation and MRP3 in cholic acid-induced cholestasis［J］．Br J Pharma-col，2007，151（3）：367－76．

Psoralen induced bile acid accumulation and cytotoxicity by inhibiting MRP2 and MRP3 in HepG2 cells

ZHOU Kun1，2，BI Ya-nan1，SHI Hong1，2
（1．Institute of Traditional Chinese Medicine，Tiangjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2．Ministry of Education Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract：Aim To investigate the toxicity of isopsor-alen in HepG2 cells and its effects on bile acid，bile acid synthesis and transport．Methods Cell viability was evaluated by MTT assay and bile acid was deter-mined inside HepG2 cells，with exposure to various isopsoralen for 24h．The mRNA transcription of BSEP，MRP2，MRP3，NTCP，OATP2，OSTα，CYP7A1，CYP27A1，F(xiàn)XR and PXR were assessed by real-time PCR．Results The cell viability was decreased dose-dependently with isopsoralen in HepG2 cells，and IC50was 118．1 μmol·L－1exposure to isopsoralen for 24h．Bile acid inside cells significantly increased with 100 and 400 μmol·L－1isopsoralen．Isopsoralen caused the down-regulation of MRP2，MRP3，CYP7A1 mRNA at 25 μmol·L－1．Beside these，the up-regulation of OATP2，OSTα，CYP27A1，F(xiàn)XR，PXR with 100 μmol· L－1isopsoralen，but there was no significant change of BSEP and NTCP．Conclusion The results show that isopsoralen induces bile acid accumulation and cytotox-icity which may be associated with the down-regulation of MRP2，MRP3 in HepG2 cells．

Key words：isopsoralen；bile acid；cytotoxicity；bile acid synthesis；bile acid transport；HepG2 cell；MRP2；MRP3

作者簡介：周 昆（1978－），男，碩士，助理研究員，研究方向：中藥毒性機制和減毒研究、藥物安全性評價，E-mail：z．k．ken ＠263．net

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81202991）；國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目（No 2011ZX09201-201-21，No 2014ZX09304307-001-005）

收稿日期：2015－03－02，修回日期：2015－04－06

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1112－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．017