邵雙雙，賀亮，韋朝陽，李衛(wèi)旗*

(1.浙江大學生命科學學院，杭州310058；2.浙江省林業(yè)科學研究院生物技術所，杭州310023)

響應面優(yōu)化黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝

邵雙雙1，賀亮2，韋朝陽1，李衛(wèi)旗1*

(1.浙江大學生命科學學院，杭州310058；2.浙江省林業(yè)科學研究院生物技術所，杭州310023)

對黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝進行研究。在單因素實驗的基礎上，選擇對蠶繭脫膠率有顯著影響的3個因素：pH(X1)、酶加量(X2)、超聲功率(X3)，進行三因素三水平的響應面分析實驗。最終確定最優(yōu)條件為：pH5.5、酶加量5.5%(E/S)、超聲功率390W、超聲處理時間35min、溫度60℃、料液比1∶30(m/v)。并且該最佳條件下脫膠率(37.62±0.34%)和脫下的絲膠蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、類胡蘿卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黃酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠，進一步表明了超聲輔助酶法脫膠的優(yōu)越性。

黃色蠶繭；脫膠；超聲波；酶法；響應面

目前，超聲波處理技術廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。超聲輔助酶解制備中的應用主要是通過超聲波能量作用于反應體系改變各個組成部分的作用方式，提高產(chǎn)物的合成效率來實現(xiàn)的[1]。蛋白酶是一種無毒無害、高效環(huán)保的生物催化劑，用蛋白酶對蠶繭脫膠已經(jīng)是脫膠工藝發(fā)展的重點，其中木瓜蛋白酶對蠶繭脫膠的綜合效果最好[2]。

天然彩色蠶繭色素主要來源于桑葉或蠶體內(nèi)自身的合成，主要包含類胡蘿卜素，且其繭層中還含有葉黃素、黃酮、絲膠蛋白等活性物質(zhì)。國內(nèi)對彩色繭提取物抑菌活性及其抗氧化活性的研究也越來越多[3-4]，而且絲膠作為食品、化妝品添加劑也具有重要的應用價值，天然彩色蠶繭的利用不僅對人們健康有益，而且符合當前消費新理念[5]。

目前，國內(nèi)對超聲輔助酶解法提取的研究越來越多[6-7]，但對天然黃色繭脫膠工藝的研究比較少。所以對黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝進行響應面優(yōu)化，并對脫膠后絲膠蛋白DPPH自由基清除率及其類胡蘿卜素和黃酮含量進行測定，為黃色蠶繭的深度開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)，使其更好服務于人類生活。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃色蠶繭下腳料湖州農(nóng)科院；木瓜蛋白酶(≥3units/mg)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 購自上海阿拉丁試劑公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-500DB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠出品；Sartorius BSA224S型電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；U-1900型可見分光光度計 日本HITACHI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脫膠率計算[8]。將脫膠前后的蠶繭烘干后放入玻璃干燥器中，于室溫下平衡30 min后稱得的質(zhì)量為脫膠前后的干質(zhì)量，脫膠率計算如式：

1.3.2 超聲波輔助酶法脫膠單因素實驗。分別以不同的超聲處理時間、料液比、溫度、pH、酶加量及超聲功率為單因素，考察各單因素對黃色蠶繭脫膠率的影響。單因素基礎實驗條件是：超聲處理30 min，溫度50℃，pH為6，酶加量為1%(E/S)，料液比為1∶40(m/v)，超聲功率為200W，脫膠1 h。各因素取值范圍：超聲時間20、25、30、35、40、45 min；溫度40、50、60、70、80℃；pH 3、4、5、6、7、8；酶加量1%、3%、4%、5%、6%、7%(E/S)；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(m/v)；超聲功率為200、250、300、400、500W。脫膠完成后，將蠶繭取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，并在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計算脫膠率。

1.3.3 超聲波輔助酶法脫膠單因素實驗。 在單因素實驗基礎上，選擇對脫膠率影響顯著的pH、酶加量和超聲功率3個因素，以脫膠率為響應值，通過響應面法(Response Surface Method，RSM)進行提取條件的優(yōu)化，并運用design-expert 8.0軟件分析得到最優(yōu)制備條件。實驗因素和水平如表1。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平

1.3.4 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)法對黃色蠶繭脫膠比較

1.3.4.1 水浴煮沸脫膠[9]。稱取50g的黃色蠶繭，置于料液比1∶40(m/v)的蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7，在電熱恒溫爐中加熱煮沸脫膠1h后，取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.4.2 酶法脫膠[10]。稱取50 g的黃色蠶繭，置于料液比為1∶40(m/v)，溫度50℃，質(zhì)量分數(shù)1%(E/S)的木瓜蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH為7，脫膠1 h后，取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，蠶繭在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，滅酶，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.4.3 超聲輔助酶法脫膠。稱取50g的黃色蠶繭，在響應面優(yōu)化后的條件下脫膠，總脫膠時間為1 h，蠶繭取出用40℃左右的去離子水洗滌3次，在105 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，滅酶，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.5 最優(yōu)條件下得到的絲膠蛋白與傳統(tǒng)法得到的絲膠蛋白比較

1.3.5.1 絲膠蛋白DPPH自由基清除率測定[11]。1.0 mL DPPH(0.2 mM)與1.0 mL的樣品混勻，室溫靜置30 min，于517 nm處測定吸光值。

A0為空白樣品吸光值，As加樣后的吸光值，Aj為以蒸餾水代替DPPH的吸光值

1.3.5.2 類胡蘿卜素含量測定[12]。稱取絲膠蛋白粉0.5g于三角瓶中，用30倍體積的石油醚：丙酮(1∶1，v/v)浸提3次，過濾，合并濾液，定容到一定體積，在450nm處測吸光值，計算絲膠蛋白中類胡蘿卜素含量。

式中：X為類胡蘿卜素含量，A為450 nm處吸光值，y為提取液總體積，A1為胡蘿卜素平均吸收系數(shù)，g是絲膠蛋白的重量。

1.3.5.3 黃酮含量測定。采用硝酸鋁顯色法進行黃酮含量的測定。根據(jù)文獻[13]方法制作蘆丁標準曲線，回歸得到吸光度A與黃酮濃度C的線性方程：A=10.70469C-0.03996，相關系數(shù)R=0.9992。

取絲膠蛋白粉末0.5g放入試管中，加入75%乙醇至10 mL，超聲30 min，再放入60℃水浴鍋里抽提1 h，過濾去除雜質(zhì)，收集抽提液，定容于25 mL標準容量瓶。取樣液5 mL，加入質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻。放置6 min，加入質(zhì)量分數(shù)10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻，放置6 min；最后加入質(zhì)量分數(shù)4%氫氧化鈉溶液2.5mL，用75%乙醇定容至10 mL，放置15min后，在510 nm波長處測定吸光度A。根據(jù)蘆丁標準曲線計算出樣品黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶法脫膠單因素實驗

2.1.1 超聲時間對黃色蠶繭脫膠率的影響

圖1 超聲處理時間對脫膠率的影響

由圖1可以看出，在超聲處理20～45 min時間內(nèi)，蠶繭脫膠率變化不大。當超聲處理35 min時，脫膠率達到最大為32.79%±0.21%；當超聲時間為40 min后，脫膠率緩慢下降，這可能是因為超聲波處理使得底物空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，減少了底物與水解酶的結(jié)合位點，進而降低了反應速度[14]。綜合考慮生產(chǎn)成本和脫膠后蛋白活性等因素影響，可以選擇超聲處理時間為35 min來進行后續(xù)實驗。

2.1.2 溫度對黃色蠶繭脫膠率的影響

圖2 溫度對脫膠率的影響

從圖2可以看出，本實驗中蠶繭在40～80℃范圍內(nèi)隨溫度升高脫膠率也升高。在80℃時脫膠率為36.27%±0.26%，說明木瓜蛋白酶對溫度具有寬泛的耐受特性，因此木瓜蛋白酶可高溫脫膠也可低溫脫膠，這與鄧一民等報道的結(jié)果類似[15]。綜合考慮生產(chǎn)成本和對脫膠蛋白活性等因素的影響，選擇溫度為60℃來進行后續(xù)實驗。

2.1.3 pH對黃色蠶繭脫膠率的影響

圖3 pH對脫膠率的影響

由圖3可知，在pH3～8范圍內(nèi)，pH值為6時脫膠率最高達33.79%±0.27%，超過此pH值，蠶繭脫膠率下降，因為酶活力受環(huán)境的影響，pH不僅影響酶的構(gòu)象，而且也影響底物的解離狀態(tài)[16]。pH值為6時，木瓜蛋白酶處于最佳pH值區(qū)間，能夠發(fā)揮木瓜蛋白酶的最大活力，因此可以選擇pH為5、6、7三個水平進行后續(xù)優(yōu)化實驗。

2.1.4 酶加量對黃色蠶繭脫膠率的影響

圖4 加酶量對脫膠率的影響

從圖4可以看出，酶加量從1%～5%(E/S)上升時，黃色蠶繭脫膠率也隨之上升，當酶加量在5%～8%(E/S)范圍內(nèi)，脫膠率變化不大。酶量越多，酶與底物作用越充分[17]，但當酶與底物的結(jié)合接近飽和時，過量的酶就不再使脫膠效果明顯提高。因此，確定酶加量為4%、5%、6%(E/S)三個水平進行后續(xù)優(yōu)化較為合適。

2.1.5 料液比對黃色蠶繭脫膠率的影響

圖5 料液比對脫膠率的影響

由圖5可知，在料液比為1∶20～1∶50(m/v)蠶繭脫膠率變化不大，料液比為1∶30(m/v)，脫膠率最大。這可能是由于絲膠蛋白本身易溶于水，加水量越多，絲膠蛋白溶解速率越快，但是酶與底物接觸減少，作用減少，導致脫膠率增長減慢，甚至減小[18]。因此，實驗中可選取料液比為1∶30(m/v)來進行后續(xù)的響應面分析實驗。

2.1.6 超聲功率對黃色蠶繭脫膠率的影響

由圖6可知，超聲功率在400W 時，脫膠率最大，在200～400W時，蠶繭脫膠率隨著功率的增大而明顯增大，但在400W之后，脫膠率減小。這可能是由于隨著超聲功率的增加，作用在底物上的超聲能增加，加快了絲膠蛋白的的溶解，但過高的功率可能破壞酶的活性中心，導致整體脫膠效果減小[19]。因此實驗中可選取300、400、500 W進行后續(xù)的響應面分析實驗。

圖6 超聲功率對脫膠率的影響

2.2 響應面結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，最終選擇對黃色蠶繭脫膠率有顯著影響的三個因素：pH(X1)，酶加量(X2)，超聲功率(X3)，進行三因素三水平的響應面分析實驗。

實驗結(jié)果見表2，利用Design Expert 8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到脫膠率Y為目標函數(shù)的一次回歸方程模型：Y=37.59-0.77X1+1.27X2-0.35X3-0.13X1X2+0.29X1X3+0.38X2X3-1.03X12-1.93X22-1.17X32。

表2 響應面實驗設計及數(shù)據(jù)處理

對回歸模型進行方差分析可以看出(表3)：模型Pr=0.0072<0.01，表明回歸方程模型極顯著；失擬項Pr=0.0633>0.05，不顯著，表明該方程對實驗擬合情況好、誤差小；模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.95474，表明方程模型與實驗數(shù)據(jù)有95.474%的符合度。結(jié)合表3和圖7～圖9對模型進行回歸方程系數(shù)顯著性分析表明：模型中X2，X22為極顯著項，X1，X12，X32為顯著項，3個因素對脫膠率影響大小順序為：X2>X1>X3，即pH>酶加量>超聲功率。X1X2，X1X3，X2X3的Pr值大于0.05，且等高線為圓形，所以3個因素的交互作用對蠶繭脫膠率的影響不顯著。

表3 回歸分析結(jié)果

圖7 pH和酶加量交互作用對脫膠率影響的響應面圖

圖8 pH和超聲功率交互作用對脫膠率影響的響應面圖

圖9 超聲功率和酶加量交互作用對脫膠率影響的響應面圖

由模型預測得到的最佳優(yōu)化條件為：pH為5.56，酶加量為5.44%(E/S)，超聲功率為390.31W。該條件下蠶絲脫膠率的預測值為37.88%?？紤]到實際操作的便利，確定最佳優(yōu)化條件為：pH為5.5，酶加量為5.5%(E/S)，超聲功率為390W，超聲處理時間為35min，溫度為60℃，料液比為1∶30(m/v)。為了檢驗方法可靠性，將上述最優(yōu)工藝條件平行做3次實驗，結(jié)果取均值。測得蠶絲脫膠率的為37.62%±0.34%，該值與理論預測值37.88%相比，其相對誤差較小(約為0.69%)。

2.3 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)方法對黃色蠶繭脫膠比較

圖10 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)法對黃色蠶繭脫膠比較

從圖10可以看出，超聲波輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脫膠(19.8%±0.21%)和酶法脫膠(26.25%±0.22%)。說明超聲輔助酶法脫膠要優(yōu)于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠。

2.4 不同方法脫膠后絲膠蛋白DPPH自由基清除率、類胡蘿卜素和黃酮含量比較

超聲輔助酶法脫膠(最優(yōu)條件)、水浴煮沸法脫膠以及酶法脫膠方法得到的絲膠蛋白中類胡蘿卜素和黃酮含量以及絲膠蛋白DPPH自由基清除率結(jié)果如表4。結(jié)果表明：DPPH自由基清除效果為：超聲輔助酶法(IC502.41±0.078mg/mL)>酶法(IC502.97±0.036mg/mL)>水浴煮沸(IC505.85±0.047 mg/mL)；類胡蘿卜素含量為：超聲輔助酶法(0.34±0.038mg/g)>酶法(0.27±0.041 mg/g)>水浴煮沸(0.16±0.024 mg/g)；黃酮含量為：超聲輔助酶法(0.59±0.062 mg/g)>酶法(0.51±0.045 mg/g)>水浴煮沸(0.32±0.076 mg/g)。

表4 絲膠蛋白類胡蘿卜素和黃酮含量以及DPPH自由基清除率

3 結(jié)論

3.1 超聲波輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脫膠(19.8%±0.21%)和酶法脫膠(26.25%±0.22%)。說明超聲輔助酶法對黃色蠶繭脫膠，比水浴煮沸法脫膠和酶法脫膠效果要好。

3.2 本文根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，優(yōu)化超聲輔助酶法對黃色蠶繭脫膠的工藝，并建立了相應的數(shù)學模型。最后確定最佳工藝條件為：pH為5.5，酶加量為5.5%(E/S)，超聲功率為390W，超聲處理時間為35min，溫度為60℃，料液比為1∶30(m/v)。該條件下蠶繭脫膠率為37.62%±0.34%，該值與理論預測值37.88%相比，其相對誤差較小(約為0.69%)。研究結(jié)果表明，中心組合設計響應面法可優(yōu)化工藝參數(shù)，為工業(yè)應用提供理論基礎。

3.3 超聲輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)和脫膠后得到的絲膠蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、類胡蘿卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黃酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠，進一步說明了超聲輔助酶法脫膠的優(yōu)越性。

[1]滕超,查沛娜,范園園,等.超聲波在酶解制備技術中的應用進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(6):13-16.

[2]丁歡,胡嵐,龍莎,等.淺析多種蠶絲脫膠方法[J].中國纖檢,2015(1):84-85.

[3]何秀玲,胡桂燕,鐘石,等.不同高絲膠繭蠶品種的絲膠蛋白抗氧化能力分析初報[J].中國蠶業(yè),2010,31(3):17-19.

[4]陳忠敏,羅琴,張瑤琴,等.絲膠蛋白的細胞相容性和抗菌性能研究[J].絲綢,2012,49(11):1-5.

[5]侯國軍,張金衛(wèi),李江濤,等.幾種天然黃色繭品種蠶繭抑菌率的測定與比較[J].蠶桑茶葉通訊,2011(4):5-7.

[6]于國泳,郭鵬,孫登岳,等.超聲輔助酶法制備山杏仁多肽[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版,2014,45(3):377-381.

[7]劉振春,韓宇,孫慧娟.超聲波輔助酶法制備綠ACE 抑制肽的工藝研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2014,42(8):125-131.

[8]鄧一民,段宣任,張高軍.生絲用酒石酸脫膠的工藝條件優(yōu)化試驗[J].蠶業(yè)科學,2010,36(5):866-869.

[9]張雨青.蠶絲脫膠方法的比較分析[J].蠶業(yè)科學,2002,28(1):75-79.

[10]王英健.幾種脫膠方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(33):14623-14624.

[11]Deng Yun, Yang Guiyun, Yue Jin, et al. Influences of ripening stages and extracting solvents on the polyphenolic compounds, antimicrobial and antioxidant activities of blueberry leaf extracts [J]. Food Control，2014,38:184-191.

[12]高慧穎,王琦,陳源,等.茂谷橘橙中類胡蘿卜素含量的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報,2010,25(2):197-200.

[13]王艷,張彥麗.分光光度法測定新疆昆侖雪菊中總黃酮的含量[J].新疆醫(yī)科大學學報,2011,34(8):817-819.

[14]韓揚,何聰芬,董銀卯,等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助酶法制備燕麥ACE抑制肽的工藝研究[J].食品科學,2009,30(22):44-49.

[15]鄧一民,張高軍,敬凌霄,等.蠶絲木瓜蛋白酶脫膠工藝條件探討[J].絲綢,2009(8):20-22.

[16]劉曉飛,劉寧,張娜,等.超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮及抑菌性檢測[J].食品科學,2014(20):79-82.

[17]馬嬌,陶海騰,徐同成,等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取小麥胚芽油的研究[J].中國糧油學報,2013,28(12):57-62.

[18]姚東瑞,周鳴謙,劉云鶴,等.響應面法優(yōu)化酶法提取泥鰍魚油的研究[J].中國糧油學報,2012,27(6):66-70.

[19]王振偉,申森.超聲波輔助酶法制備殼寡糖及抗氧化活性研究[J].中國食品添加劑,2014(4):70-75.

Process Optimization of Ultrasonic-assisted Enzymatic Degumming of Yellow Cocoons by Response Surface Methodology

Shao Shuangshuang1, He Liang2,Wei Chaoyang1,Li Weiqi1*

(1.College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058;2.Institute or Biological Technology, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023)

The purpose of this research is to study the process of ultrasonic-assisted enzymatic degumming of yellow cocoons. Based on the single factor tests, the three factors: pH (X1), enzyme amount (X2), and the ratio of material to solvent (X3) had a significant impact on degumming rate of natural yellow cocoons. Then the three factors were assessed by response surface methodology (RSM) involving a three factors and three levels. The optimal process was determined as follows: the pH was 5.5, the enzyme amount was 5.5% (E/S), the ultrasonic power was 390 W , the ultrasonic treatment time was 35 min, the temperature was 60℃, and the ratio of material to solvent was 1∶30(m/v). Under such conditions, the ultrasonic-assisted enzymatic has higher degumming rate of 37.62%±0.34%, and the sericin protein after ultrasonic-assisted enzymatic degumming has higher DPPH scavenging activity (IC502.41±0.078mg/mL), content of carotenoids (0.34±0.038mg/g), and flavonoids (0.59±0.062mg/g) than boiling water bath and enzymatic degumming. The ultrasonic-assisted enzymatic degumming was further demonstrated superior.

Yellow cocoons; Degumming; Ultrasonic; Enzyme; Response surface methodology

2015-05-26

浙江省科技攻關計劃(2014C32085)；浙江省科技攻關計劃(2013GZ09)

邵雙雙(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：微生物學；*通訊作者：李衛(wèi)旗(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵,E-mail:kite006@163.com。

TS202.3

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.001