曹思明，　韓立杰，　張玲，　金鐵巖,*

( 1.延邊大學理學院 化學系， 吉林 延吉 133002； 2.延邊大學農學院 食品科學系， 吉林 延吉 133002 )

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榛花粉不同提取物組分抗炎癥活性研究

曹思明1，韓立杰2，張玲2，金鐵巖1,2*

( 1.延邊大學理學院 化學系， 吉林 延吉 133002； 2.延邊大學農學院 食品科學系， 吉林 延吉 133002 )

摘要：以榛花粉為原材料，得到榛花粉乙醇提取物，然后分別利用不同溶劑對榛花粉乙醇提取物進行提取得到不同組分;將榛花粉不同提取組分對RAW 264.7細胞進行抗炎癥實驗、PGE2生成實驗、誘發(fā)胃炎和肝炎的動物實驗，實驗結果表明：二氯甲烷組分和乙酸乙酯組分都對RAW 264.7細胞中NO和PGE2的生成具有明顯的抑制效果，且均存在較高的濃度依存性關系；二氯甲烷組分對胃炎病變部位有一定治療作用，對肝損傷細胞中的ALT活性的升高具有一定抑制作用. 榛花粉； 乙醇提取物； 抗炎癥活性 TS202.1

文獻標識碼：A

榛花為樺木科(Betulaceae)植物榛和毛榛的雄花，含有蛋白質、維生素、碳水化合物、脂肪等大多數(shù)與人體生命活動相關的營養(yǎng)成分，主要生長在我國東北、華北地區(qū)，資源豐富[1].研究表明，榛花具有消炎、降血糖、止血等作用[2].目前，針對榛花性質和作用的研究大多集中在抗氧化、降血糖領域，例如：2005年蔡英蘭等[3]通過生化檢測、免疫組織化學、透射電子顯微鏡技術等研究方法，觀察了榛花在降糖過程中所起到作用，結果表明榛花具有降低糖尿病實驗小鼠高血糖的作用.2011年師偉[4]對榛花的抑菌活性及其藥學活性進行了研究.2007年高國粉等[5]研究發(fā)現(xiàn)榛花中存在大量的黃酮類化合物，并通過鄰苯三酚氧化法檢測了榛花的抗氧化能力.

榛花花粉作為榛花的雄性生殖細胞，幾乎含有榛花全部的營養(yǎng)元素，而對其研究較少;因此，有必要對榛花粉的相關性質進行研究.本文實驗選取野生榛花花粉為實驗對象，對榛花粉乙醇提取物在不同溶劑下的各個提取組分，進行RAW 264.7細胞的抗炎癥實驗、PGE2(前列腺素E2)生成實驗、誘發(fā)胃炎和肝炎的動物實驗，并對榛花粉各提取組分的抗炎癥活性進行了評價.

1材料與儀器

1.1　實驗材料與試劑

長白山野生榛花花粉；乙醇(C2H5OH)、正己烷(n-hexane)、鹽酸(HCl)、二氯甲烷(CH2Cl2)、四氯化碳(CCl4)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(BuOH)為AR級，均購于Aladdin試劑公司；二甲亞砜(DMSO)、Griess試劑Sigma公司生產；滅活胚牛血清(FBS)為江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司生產；細菌脂多糖(LPS)為上海前塵生物科技有限公司生產；乳酸脫氫酶(LDH)為上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產.

1.2　實驗儀器

電子天平：B224S型，立特電子(德國)科技公司；旋轉蒸發(fā)儀：EE-5250型，西安省太康科技集團；分光光度計(紫外)：LS576型，美國Bwtek高科技(上海)公司；恒溫水浴鍋：HS -1型，南京舜異儀器有限公司；恒溫搖床：HZ-2411K型，常州市凱航儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱：SHELLAB 2514-2型，北京伯樂有限公司；水平振蕩器：MS-l型，德國IKA公司；酶標儀：Sergy型，深圳愛康科技(美國)有限公司；DMEM培養(yǎng)基.

2實驗方法

2.1　榛花粉提取物組分的制備

取干燥后的榛花粉1 g加入10 mL體積分數(shù)為95%的乙醇溶劑，室溫下浸泡12 h后將粗提取物過濾，旋轉蒸發(fā)除去其中溶劑，得到干燥的榛花粉乙醇提取物.

將干燥好的榛花粉乙醇提取物利用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水5種溶劑分別進行梯度提取，采用超聲震蕩30 min，過濾并收集濾液，得到榛花粉在不同溶劑中的各個提取組分，低溫避光保存，備用.

2.2　榛花粉不同提取物組分抗炎癥活性的測定

2.2.1細胞培養(yǎng)根據文獻[6-7]，將巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)在加入抗生素(青霉素、鏈霉素)100 units/mL、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃和5% CO2的條件下續(xù)代培養(yǎng)，每3 d 1次.

2.2.2動物實驗雄性昆明小鼠，6~8周齡，體質量17~21 g，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)在塑料籠子中.

2.2.3NO的生成測定在添加10%滅活FBS的DMEM培養(yǎng)基中，將RAW 264.7細胞調節(jié)到1.5×105cells/mL，然后接種到細胞培養(yǎng)板上，用榛花粉各個提取組分和LPS(1 μg/mL)同時處理，并培養(yǎng)24 h.由于NO不穩(wěn)定，它在細胞培養(yǎng)的上清液內會快速代謝生成亞硝酸基(NO2-)，因此本實驗參考Griess法測定NO2-的濃度，以此作為衡量NO水平的指標[8].具體方法是：將100 μL細胞培養(yǎng)液的上清液和100 μL Griess試劑[2.5%(v/v)磷酸中添加1%(w/v)對氨基苯磺酰胺和0.1%(w/v)N-萘乙二胺鹽酸鹽]混合，在細胞培養(yǎng)板中反應10 min，然后在540 nm下測定吸光值.

2.2.4細胞毒性測定分別利用榛花粉各個提取組分和LPS(1 μg/mL)同時處理RAW 264.7細胞(1.5×105cells/mL)，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h.在3 000 r/min下離心5 min.對培養(yǎng)上清液中的LDH進行測定，以此評價細胞毒性.LDH測定是利用試劑盒方法進行的，具體方法為：在96孔板離心分離得到的上清液50 μL中加入稀釋的WST底物混合物50 μL，在室溫中反應30 min.在490 nm波長處測定吸光度，求得各個實驗組的平均吸光值，并與對照組(LDH對照，1∶5 000)的吸光度值比較，以此評價不同提取組分對細胞毒性的影響.

2.2.5PGE2的生成評價根據文獻[9]，利用DMEM培養(yǎng)基將RAW 264.7調節(jié)到1.5×105cells/mL后接到24孔板上，并在恒溫狀態(tài)含5% CO2的條件下培養(yǎng)18 h.將培養(yǎng)基去除，對含調到10倍濃度的(1 mg/mL)榛花粉提取組分50 μL和450 μL LPS(1 μg/mL)的新培養(yǎng)基同時進行處理，并在上述相同條件下培養(yǎng)24 h.為測定PGE2，將培養(yǎng)基進行離心分離(12 000 r/min,3 min)獲得上清液.用PGE2 ELISA試劑盒測定，R2值大于0.99.

2.2.6C2H5OH/HCl誘發(fā)胃炎的動物實驗根據文獻[10]方法，利用C2H5OH/HCl誘發(fā)小鼠胃炎.選取同批次的健康雄性小鼠40只，每組10只.第I組為正常對照組，第II組為模型組，第III組為待測物組，第IV組為陽性對照組.第I、II組灌胃等量生理鹽水，第III組口服榛花粉提取物200 mg/kg，第IV組以雷尼替丁(40 mg/kg)灌胃[11]，每天2次，持續(xù)3 d.榛花粉提取組分在體內劑量的選擇根據文獻[11]進行，即給予小鼠以50~300 mg/kg的量.在對小鼠最后灌胃30 min以后，除正常對照組外，另外3組均給予口服60% C2H5OH、150 mmol/L的HCl 400 μL.用乙醚麻醉小鼠，將其致死.無菌條件下開腹，結扎幽門部位，并將胃部切除，用流動水沖洗[11]后展開并觀察病變部位.

2.2.7CCl4誘發(fā)肝炎的動物實驗根據文獻[12]方法，通過腹腔注射CCl4誘發(fā)小鼠肝炎.選取同批次的健康雄性小鼠30只，每組10只.第I組為正常對照組，第II組為肝損傷模型組，第III組為待測物組.第I、II組灌胃等體積生理鹽水，第III組口服榛花粉提取組分200 mg/kg，每天1次，持續(xù)1周.實驗期間，小鼠正常攝食，飲水，鼠籠每天更換墊料.

在對小鼠最后灌胃60 min以后，正常對照組除外，其他組腹腔注射CCl4，乙醚麻醉小鼠，將其致死.將肝臟切除，用流動水沖洗.采血后，對血液進行離心分離，得到血清后按照試劑盒測定丙氨酸氨基轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)的活性.

2.2.8數(shù)據分析利用SPSS對實驗所得數(shù)據進行分析，數(shù)值表示均是平均值+標準偏差，P<0.05可以認為具有顯著性差異.

3實驗結果與討論

3.1　榛花粉不同提取物組分抗炎癥活性評價

3.1.1榛花粉不同提取物組分對RAW 264.7細胞中NO的生成和細胞毒性的影響榛花粉不同提取組分(25 μg/mL)對RAW 264.7細胞中NO的生成和細胞毒性的影響如圖1所示.CH2Cl2組分和EtOAc組分比對照組(LPS單獨處理)具有更強的NO生成抑制效果；在LDH分析中，CH2Cl2組分表現(xiàn)出60%的細胞毒性.(本文所有圖中“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極其顯著(P<0.01)).

圖1　榛花粉各提取組分對RAW 264.7細胞中NO的生成和細胞毒性的影響

榛花粉CH2Cl2提取組分對RAW 264.7細胞中NO生成的影響如圖2所示.CH2Cl2組分比對照組(LPS單獨處理)表現(xiàn)出更高的濃度依存性(6.25、12.5、25 μg/mL)，由此能夠確認其對NO生成的抑制效果；CH2Cl2組分在12.5、25 μg/mL濃度下各表現(xiàn)出18%、60%的細胞毒性.

圖2　榛花粉CH2Cl2組分對RAW 264.7細胞中NO生成和細胞毒性的影響

榛花粉EtOAc提取組分對RAW 264.7細胞中NO生成的影響如圖3所示.EtOAc組分比對照組(LPS單獨處理)仍表現(xiàn)出較高的濃度依存性(6.25、12.5、25 μg/mL)，并對NO的生成具有明顯的抑制效果，但未表現(xiàn)出細胞毒性.

圖3　榛花粉EtOAc組分對RAW 264.7細胞中NO生成和細胞毒性的影響

3.1.2榛花粉不同提取組分對RAW 264.7細胞中PGE2生成的影響榛花粉不同提取組分對RAW 264.7細胞中PGE2生成的影響如圖4所示.CH2Cl2組分和EtOAc組分比對照組(LPS單獨處理)對PGE2的生成具有更強的抑制效果.

圖4　榛花粉各提取物對RAW 264.7細胞中PGE2生成的影響

榛花粉CH2Cl2提取組分對PGE2生成的抑制效果如圖5所示.CH2Cl2組分相比對照組(LPS單獨處理)表現(xiàn)出更高的濃度依存性(6.25、12.5、25 μg/mL)，由此可確認其對PGE2的生成具有明顯抑制作用.

圖5　榛花粉CH2Cl2組分對RAW 264.7細胞中PGE2生成的影響

榛花粉EtOAc提取組分對PGE2生成的影響如圖6所示.EtOAc組分相比對照組表現(xiàn)出更高的濃度依存性，且同樣可確認其對PGE2的生成具有顯著的抑制效果.

圖6　榛花粉EtOAc組分對RAW 264.7細胞中PGE2生成量的影響

3.1.3動物實驗結果利用C2H5OH/HCl對實驗性小鼠進行誘發(fā)胃炎的實驗結果如圖7所示.由圖7可知，榛花粉提取物對病變部位有較好的減輕效果，但不如雷尼替丁明顯.

圖7　榛花粉提取組分對小鼠胃炎病變的影響

CCL4能對肝臟造成嚴重損害，其主要作用機制是四氯化碳在機體內部的活性代謝和直接的膜溶解作用，引起胞漿內Ca2+濃度上升，造成肝細胞受損[13].榛花粉提取物對小鼠血清中AST和ALT測定結果如圖8所示.

圖8　榛花粉提取物對小鼠血清中AST和ALT活性的影響

正常肝細胞中的AST和ALT不能被釋放到血液中，但是，當肝細胞受到損傷時,血液中AST和ALT的活性增加[14-15]，其中ALT反應靈敏性優(yōu)于AST.由圖8可以看出，AST和ALT的活性有顯著提高(P<0.05).相比較而言，榛花粉提取物能抑制血清中ALT活性的升高(P<0.05)，但對AST活性的抑制不是非常明顯.

4結論

對榛花粉各個提取組分進行了抗炎癥活性實驗，結果表明：各提取物組分對NO和PGE2的生成有明顯抑制效果，且無細胞毒性；提取物組分對胃炎病變部位有較好的減輕效果，各提取物組分能明顯抑制小鼠血清中ALT的活性，對肝臟有一定的保護作用.從實驗結果推測，榛花粉中存在著某些活性化學成分，對治療炎癥可能具有很好的治療功能.

參考文獻：

[1]劉新成,孫佳明,白路,等.榛花化學成分研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥,2013,15(11):940-942.

[2]南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典：下冊[M].上海：上?？萍技夹g出版社,2006:3561.

[3]蔡英蘭,金政,金香子,等.榛花對糖尿病小鼠降糖作用及對肝臟和胰島病理學影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2005,32(12):1324-1326

[4]師偉.榛花中抑制金黃色葡萄球菌化合物的篩選及抑菌機制的研究[D].沈陽：遼寧師范大學,2011:26-47

[5]高國粉,衰利佳,劉仙,等.榛花總黃酮的提取及抗氧化活性的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2007,8:547-549.

[6]Limsuwan S, Hesseling-Meinders A, Voravuthikunchai S P, et al. Potential antibiotic and anti-infective effects of rhodomyrtone fromRhodomyrtustomentosa(Aiton) Hassk.on Streptococcus pyogenes as revealed by proteomics[J]. Phytomedicine, 2011,18(11):934-940.

[7]黃桂東,鐘先鋒,吳龍奇，等.共軛亞油酸混合物對人結腸癌細胞(Caco-2)的抑制作用[J].食品與機械,2007,23(4):49-51.

[8]Jeong D, Yang W S, Yang Y, et al. In vitro and in vivo anti-inflammatory effect of Rhodomyrtus tomentosa methanol extract[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013,146(1):205-213.

[9]Yang Y, Yu T, Jang H J, et al. In vitro and in vivo anti-inflammatory activities of Polygonum hydropiper methanol extract[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011,139(2):616-625.

[10]Lee S J, Park J Y, Choi K S, et al. Efficacy of Korean red ginseng supplementation on eradication rate and gastric volatile sulfur compound levels afterHelicobacterpylorieradication therapy[J]. Journal of Ginseng Research, 2010,34(2):122-131.

[11]Abu-Ghefreh A A, Canatan H, Ezeamuzie C I. In vitro and in vivo anti-inflammatory effects of andrographolide[J]. International Immunopharmacology, 2009,9(3):313-318.

[12]Cho J Y, Yeon J D, Kim J Y, et al. Hepatoprotection by human epidermal growth factor (hEGF) against experimental hepatitis induced by D-galactosamine (D-galN) or D-GalN/lipopolysaccharide[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2000,23(10):1243-1246.

[13]劉建文.藥理實驗方法學：新技術與新方法[M].北京：化學工業(yè)出版社,2008.

[14]Palmes D, Spiegel HU. Animal models of liver regeneration[J]. Biomaterials, 2004,25(9):1601-1611.

[15]齊志宏.天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)37 ℃參考測定程序的建立及其臨床應用[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學，2006.

Research of anti-inflammatory activity for difference Hazel pollen extracts

CAO Siming1,HAN Lijie2,ZHANG Ling2,JIN Tieyan1,2*

( 1.DepartmentofChemistry,CollegeofScience,YanbianUniversity,Yanji133002,China;

2.DepartmentofFoodScience,CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji133002,China)

Abstract：We used Hazel pollen as raw material, obtained Hazel pollen ethanol extract, then using different solvents to extract them to get different components which were checked with RAW 264.7 cells anti-inflammatory, PGE2, induced gastritis and hepatitis animal. The results show that methylene chloride and ethyl acetate extracted components have significant inhibitory effect on generation of NO and PGE2 of RAW 264.7 cells and higher concentration dependence relationship; Methylene chloride extracted component has the rapeutic effect on gastritis lesions and can reduce elevated ALT activity in injured liver cells with a certain extent.

Key words：Hazel pollen; ethanol extract; anti-inflammatory activity

文章編號：1004-4353(2015)04-0326-05

*通信作者：金鐵巖(1968—)，男，博士，副教授，研究方向為功能性食品.

收稿日期：2015-11-07