曾維才,于志龍,張文華,石

(四川大學 皮革化學與工程教育部重點實驗室,四川 成都 610065)

·研究報告——生物質活性成分·

牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的抑制

(四川大學 皮革化學與工程教育部重點實驗室,四川 成都 610065)

通過考察H2O2濃度和作用時間對細胞活力的影響，確定PC12細胞氧化損傷模型的建立條件；通過細胞活力及形態(tài)分析，測定牛毛水解物對H2O2致PC12細胞氧化損傷的抑制作用。結果表明，H2O2濃度0.15 mmol/L、作用時間2 h為建立PC12細胞氧化損傷模型的理想條件；不同質量濃度的牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)可有效抑制H2O2對PC12細胞的氧化損傷，使細胞活力達到58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%，也能在一定程度上修復氧化損傷的細胞，使其活力恢復至53.69%、 57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，還能有效地維持細胞原有的形態(tài)特征。

牛毛;水解物;PC12細胞;氧化損傷;抑制作用

牛毛是畜牧養(yǎng)殖業(yè)和皮革加工業(yè)的一種副產物，其蛋白質含量高達85%以上，是一種潛在的可再生動物生物質資源[1]。牛毛主要由α-螺旋角蛋白構成，結構中富含半胱氨酸和雙硫鍵等特殊的氨基酸及官能團[2]。因具有特別的化學組成及空間結構，角蛋白展現出特殊的物理、化學及生物學性質[3]，已在皮革工業(yè)、農牧飼料工業(yè)、材料工業(yè)及日化工業(yè)得到了一定的應用[4-7]。中樞神經系統(tǒng)是指揮人體進行正常生命活動的重要生理系統(tǒng)，由神經細胞形成的神經節(jié)、神經索、腦和脊髓以及它們之間的連接成分組成[8]。其結構中含有大量的神經網絡，能接受全身各處傳入的信息，經處理后再輸出運動性指令，完成各種生命活動[9]。同時，中樞神經系統(tǒng)也是人體學習、記憶及各種思維活動的神經基礎，對其他生命活動的正常運行有重要作用[10]。由于新陳代謝活躍，中樞神經系統(tǒng)極易受到自由基的氧化攻擊，引發(fā)阿茲海默癥、帕金森綜合癥、神經萎縮、神經衰弱、神經瘤等多種嚴重危害人體健康的神經性疾病[11]。大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞(PC12)與人體腎上腺皮質細胞和交感神經元具有許多相似的生理特征，能夠分泌并表達多巴胺轉運體，是研究神經細胞常用的一種細胞系，已被廣泛用于研究物質對神經元氧化損傷的影響[12-13]。作者的前期相關實驗研究發(fā)現，牛毛水解物具有較好的抗氧化活性，能有效清除實驗體系中的多種自由基并抑制脂質過氧化的發(fā)生[14]。在此基礎上，作者進一步觀察牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的抑制作用，以期為其在生物醫(yī)藥領域的開發(fā)利用提供實驗理論基礎。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

牛毛由浙江瑞星皮革有限公司提供，取自成年雄性黃牛(BostaurusdomesticusGmelin)。經水洗、除雜，50 ℃干燥3 d，真空保存，備用。樣品標本(編號：013)保存于皮革化學與工程教育部重點實驗室(四川大學)。

大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)購于中科院上海細胞所； H2O2、 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、胰蛋白酶購于美國Sigma-Aldrich公司；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG(2.4 AU/g)購于丹麥Novo公司； Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基、小牛血清、L-谷氨酰胺購于成都東勝科創(chuàng)生物有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、青霉素(8×105U/瓶)、鏈霉素(1×106U/瓶)、二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇等其他化學試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

PHS-3型酸度計，杭州奧立龍科技儀器有限公司； Milli-Q Element超低元素型超純水系統(tǒng)，上海晶儀科學儀器有限公司； MCO-15AC型CO2細胞培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司； IX-81型倒置生物顯微鏡，日本Olympus公司；血球計數板，上海醫(yī)用光學儀器廠； 550型酶標儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛毛水解物的制備[15]按照作者前期研究確定的實驗方法，制備牛毛水解物并對其水解度及分子質量分布進行測定。取10 g牛毛樣品與100 mL NaOH溶液(體積分數為1%)混合，90 ℃水浴水解2 h，水解液10 000 r/min離心15 min。上清液用HCl溶液(0.5 mol/L)調pH值至8.5，按酶用量5%(以底物質量為基準)加入Alcalase堿性蛋白酶，55 ℃水浴攪拌水解8 h。水解液10 000 r/min離心15 min，上清液冷凍干燥得牛毛水解物。用該方法得牛毛水解物8.79 g，牛毛的水解率為87.9%。蛋白質的水解度(DH)是指蛋白質在水解過程中裂解的肽鍵數占蛋白質總肽鍵數的百分數，是衡量蛋白質水解程度的一項重要指標。通過測定，牛毛水解物的水解度為38.97%，說明牛毛中的角蛋白在堿和堿性蛋白酶Alcalase的化學-酶協(xié)同作用下發(fā)生了強烈的水解。經高效凝膠色譜法分析，牛毛水解物的分子質量主要分布在1 600～18 000 u之間[15]。

1.3.2實驗溶液的配制 無菌超純水：超純水在121 ℃、 102.9 kPa條件下滅菌30 min，備用。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4)：稱取1.56 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)、 0.27 g磷酸二氫鉀、 0.2 g氯化鉀及8.0 g氯化鈉溶于1 000 mL無菌超純水，0.22 μm微孔濾膜過濾后4°C保存，備用。胰蛋白酶溶液(質量濃度25 g/L)：稱取2.5 g胰蛋白酶均勻分散于100 mL PBS緩沖液，4 ℃放置過夜，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，每10 mL分裝一小瓶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r用PBS緩沖液稀釋至質量濃度為2.5 g/L。雙抗溶液(青霉素、鏈霉素)：將青霉素溶于4 mL無菌超純水，鏈霉素溶于5 mL無菌超純水，4 ℃保存?zhèn)溆?。? 000 mL RPMI1640培養(yǎng)基使用前加入0.5 mL青霉素溶液和0.5 mL鏈霉素溶液。小牛血清：取-20 ℃凍藏保存的小牛血清在56 ℃水浴條件下孵育30 min，無菌檢驗后使用。RPMI1640培養(yǎng)基臨用前加入小牛血清至體積分數為10%。L-谷氨酰胺溶液(0.2 mol/L)：取2.922 gL-谷氨酰胺溶于無菌超純水，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存。每1 000 mL RPMI1640培養(yǎng)基使用前加入10 mLL-谷氨酰胺溶液。RPMI1640培養(yǎng)基：取RPMI1640培養(yǎng)基50 g溶于2 000 mL無菌超純水，加入2 g碳酸氫鈉并調pH值至7.2，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，每500 mL分裝一瓶，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＥＣ馕锶芤海阂訰PMI1640培養(yǎng)基為溶劑，配制質量濃度分別為10、 20、 40、 60、 80、 100和120 mg/L的牛毛水解物溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。MTT溶液(5 g/L)：取0.5 g MTT溶于100 mL PBS緩沖液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。

1.3.3 細胞的傳代培養(yǎng) 取致密單層的PC12原代細胞，加入少量PBS緩沖液清洗原培養(yǎng)液及細胞碎片后棄去PBS緩沖液。加入1 mL胰蛋白酶溶液對細胞進行消化，待細胞充分消化后棄去胰蛋白酶溶液，加入PBS緩沖液20 mL，用吸管反復吹打至細胞均勻分散，將含有細胞的PBS緩沖液在1 500 r/min、 4 ℃條件下離心10 min，棄去上層清液，重復操作3次。在離心得到的沉淀中加入RPMI1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，將細胞懸液分裝于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天為細胞更換培養(yǎng)液；每3 d重復上述操作，為細胞傳代；每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)；參照文獻[16]取對數生長期的PC12細胞進行實驗。

1.3.4 MTT比色法測定細胞活力 MTT比色法是生化實驗中測定細胞活力的常用方法。細胞內生成的甲瓚經DMSO溶解后形成藍色溶液并在波長570 nm(或490 nm)處有特征吸收，可通過酶標儀測定溶液的吸光度，根據溶液吸光度值的大小表征受試細胞活力的大小[17]。MTT法的具體操作參照文獻[18]進行，細胞活力計算如下：

細胞活力=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%

1.3.5 H2O2致PC12細胞氧化損傷模型的建立 取對數生長期PC12細胞接種于96孔細胞板，接種密度1×105個/孔，接種量100 μL/孔。在37 ℃、 5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度H2O2(0.05、 0.1、 0.15、 0.2和0.25 mmol/L)20 μL分別培養(yǎng)1、 2、 3、 4、 5 h，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗3次，采用MTT法測定細胞活力，確定合適的H2O2濃度和培養(yǎng)時間用于PC12細胞氧化損傷模型的建立。

1.3.6 牛毛水解物對PC12細胞生長活力的影響 取對數生長期PC12細胞，加入不同質量濃度牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80、 100、 120 mg/L)20 μL作用24 h，采用MTT法觀察牛毛水解物對PC12細胞生長活力的影響，確定后續(xù)實驗中牛毛水解物的質量濃度范圍。

1.3.7 牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的抑制作用 用不同質量濃度范圍的牛毛水解物20 μL與對數生長期PC12細胞作用2 h，PBS緩沖液清洗后加入H2O2(0.15 mmol/L)20 μL作用2 h。采用MTT法測定不同濃度牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的抑制作用。設置正常生長的PC12細胞為空白組，只受H2O2損傷的PC12細胞為損傷組。

1.3.8 牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的修護作用 采用不同濃度的牛毛水解物20 μL同已被H2O2氧化損傷的PC12細胞作用24 h，通過MTT法測定不同濃度牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的修護作用。

1.3.9 PC12細胞的形態(tài)觀察 取空白組、損傷組及牛毛水解物(80 mg/L)作用組的PC12細胞，分別用PBS緩沖液清洗3次，置于倒置顯微鏡下觀察，對比各組PC12細胞外觀形態(tài)的變化。

1.3.10 數據統(tǒng)計與分析 每組實驗重復操作3次，實驗結果用SPSS12.0軟件(version 12.0 for Windows,

圖1 H2O2對PC12細胞的氧化損傷

SPSS Inc.,CO,USA)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 H2O2致PC12細胞氧化損傷模型的建立

不同濃度H2O2在不同作用時間內對PC12細胞的氧化損傷情況如圖1所示。

由圖1數據可知，H2O2對PC12細胞的活力有顯著影響。隨H2O2受試濃度(0.05～0.25 mmol/L)的增加，PC12細胞的活力明顯下降，呈現顯著的劑量-效應關系；同一受試濃度下，隨作用時間(1～5 h)的延長，PC12細胞的活力也逐漸下降。結果表明，H2O2是一種良好的氧化引發(fā)劑，能有效地對生物細胞造成氧化損傷，可用于PC12細胞氧化損傷模型的建立。通常情況下，選取使細胞活力下降約50%的氧化劑濃度和損傷時間用于細胞氧化損傷模型的建立[16]。分析圖1可知，當H2O2的濃度為0.15 mmol/L、作用時間為2 h時，PC12細胞的活力降低至48%，接近半數致死劑量，是較為理想的氧化損傷條件。因此，實驗選用0.15 mmol/L的H2O2與細胞作用2 h作為建立PC12細胞氧化損傷模型的條件。

表1 牛毛水解物對PC12細胞生長活力的影響

表2 牛毛水解物對H2O2致PC12細胞氧化損傷的抑制作用

2.2 牛毛水解物對PC12細胞生長活力的影響

牛毛水解物對PC12細胞生長活力的影響如表1所示。

由表1可知，不同濃度的牛毛水解物在24 h內對PC12細胞均具有一定的生理毒性，可在一定程度上降低細胞的生長活力。當水解物濃度高于80 mg/L時，PC12細胞的生長活力降低至90%以下，不利于后續(xù)實驗的進行。因此，選用80 mg/L為后續(xù)實驗中牛毛水解物的最高受試濃度。

2.3 牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的抑制作用

不同濃度的牛毛水解物對H2O2致PC12細胞氧

化損傷的抑制作用如表2所示。

由表2可知，如果將未受H2O2氧化損傷的細胞活力定義為100%，損傷組細胞因受到H2O2氧化，細胞生長受阻，活力下降至48.62%。經不同質量濃度(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)牛毛水解物的作用，各組PC12細胞在被H2O2氧化損傷2 h后的活力分別維持在58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%。同氧化損傷組相比，隨著牛毛水解物作用濃度的提高，PC12細胞對H2O2氧化攻擊的抵抗力逐漸增強，細胞活力降低的情況逐漸得到緩解，表現出良好的劑量-效應關系。結果表明，牛毛水解物可有效地降低H2O2對細胞的氧化攻擊，對H2O2致PC12細胞的氧化損傷有顯著的抑制作用。

牛毛水解物對H2O2致PC12細胞氧化損傷的抑制作用可能與其較強的抗氧化活性有關[15]。H2O2及其衍生出的羥自由基可與細胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應，生成丙二醛等過氧化產物。這些產物同細胞膜中的蛋白質、脂類、糖類等物質交聯，破壞細胞膜的結構，改變細胞膜的正常生理功能，造成細胞的氧化損傷，阻礙細胞的正常生長，最終引發(fā)細胞的凋亡[19-21]。根據相關研究可知[14-15]，牛毛水解物能有效地清除實驗體系中的H2O2及羥自由基，阻斷細胞膜中自由基鏈式反應的進行，抑制細胞膜脂質過氧化反應的發(fā)生，維持細胞膜完整的生理結構和正常的生理功能。因此，牛毛水解物能提高PC12細胞對H2O2氧化攻擊的抵抗力和耐受度，保持細胞原有的活力，對H2O2致PC12細胞的氧化損傷具有顯著的抑制作用。

2.4 牛毛水解物對PC12細胞氧化損傷的修護作用

實驗進一步觀察了牛毛水解物對已受損PC12細胞的修護作用，結果如表3所示。

由表3可知，牛毛水解物對已氧化損傷的PC12細胞具有一定的修護作用?？瞻捉M細胞未受H2O2攻擊，正常生長，細胞活力為100%；損傷組細胞經H2O2氧化，活力下降至47.25%；各實驗組PC12細胞在氧化損傷后經不同濃度(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)牛毛水解物的修護，細胞活力恢復至53.69%、

表3 牛毛水解物對H2O2致PC12細胞氧化損傷的修護作用

57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，表現出良好的劑量-效應關系。結果說明，牛毛水解物不僅可以提高細胞對H2O2氧化攻擊的抵抗力和耐受度，有效地保護細胞免受氧化損傷，還能在一定程度上對已氧化受損的細胞發(fā)揮生物修護作用，提高其細胞活力。

牛毛水解物對細胞氧化損傷的修護作用可能與其結構中含有的大量抗氧化性氨基酸及抗氧化性官能團有關。磷脂雙分子層內發(fā)生的脂質過氧化是導致細胞凋亡的主要原因。脂質過氧化是一類典型的自由基鏈式反應，為多不飽和脂肪酸在氧氣作用下逐步發(fā)生的一種氧化變質現象。反應過程既需要自由基的引發(fā)，也產生大量自由基。同時，又要依靠自由基的推動作用才能進一步發(fā)生。在生物體內發(fā)生的脂質過氧化反應會產生大量的有毒物質，引起生物質膜的功能缺失、生化酶活性的減弱、細胞內生物大分子的降解，從而加速細胞的凋亡[22-24]。研究發(fā)現，牛毛水解物中富含半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等抗氧化性氨基酸及巰基、羥基等具有較強氫質子給予能力的官能團，能有效的淬滅細胞內外的活性氧、抑制自由基的產生、阻斷自由基鏈式反應的發(fā)生與發(fā)展[14-15]，從而有利于生物細胞膜的再生，對受損細胞展現出一定的修護能力。

2.5 PC12細胞的形態(tài)觀察

取空白組、損傷組及經牛毛水解物(80 mg/L)作用的PC12細胞于倒置顯微鏡下觀察，各組細胞的形態(tài)如圖2所示。

圖2 PC12細胞的形態(tài)觀察

由圖2可知，未受H2O2氧化攻擊的PC12細胞(圖2a)生長狀況良好，保持原有的梭狀形態(tài)，細胞兩端的突觸明顯，細胞連接緊密；受H2O2氧化攻擊的PC12細胞(圖2b)形態(tài)結構出現明顯改變，細胞形狀轉變?yōu)椴灰?guī)則的球形及橢圓形，細胞兩端的突觸收縮，細胞數量減少，細胞間連接疏松，生長狀況不好；經牛毛水解物(80 mg/L)的作用(圖2c)，大部分的PC12細胞能維持原有的細胞形態(tài)，并表現出良好的生長狀況。細胞形態(tài)觀察結果說明，牛毛水解物能保護PC12細胞免受H2O2的氧化攻擊，維持細胞原有的形態(tài)結構特征。

3 結 論

3.1 實驗確定H2O2濃度0.15 mmol/L、作用時間2 h為建立PC12細胞氧化損傷模型的理想條件。

3.2 不同質量濃度的牛毛水解物(10、 20、 40、 60、 80 mg/L)均可有效地抑制H2O2對PC12細胞的氧化損傷，使細胞活力維持到58.79%、 67.53%、 76.89%、 85.96%、 87.58%，也能在一定程度上修復氧化受損的細胞，使其活力恢復至53.69%、 57.18%、 62.56%、 65.68%、 67.23%，還能有效地維持細胞原有的形態(tài)特征。

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Inhibitory Effect of Bovine Hair Hydrolysate on Oxidative Injury of PC12 Cells

ZENG Wei-cai,YU Zhi-long,ZHANG Wen-hua,SHI Bi

(Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of the Education Ministry,Sichuan University, Chengdu 610065, China)

The inhibitory effect of bovine hair hydrolysate on the oxidative injury of PC12 cells was investigated.Based on the influence of H2O2concentration and incubation time on cell vitality,the conditions for preparing oxidative injury of PC12 cells were determined.Results showed that 0.15 mmol/L of H2O2and 2h of incubation time were the suiTable conditions to injury PC12 cells for further experiment.According to the measurement of cell vitality and observation of cell morphology,bovine hair hydrolysate (10,20,40,60,80 mg/L) exhibited significant capability to inhibit the oxidative injury of PC12 cells induced by H2O2(recovering the cell viability to 58.79%,67.53%,76.89%,85.96%,87.58%,respectively),and showed the repair ability to the oxidative injury of cells (recovering the cell viability to 53.69%,57.18%,62.56%,65.68%,67.23%,respectively).Meanwhile,it also possessed a strong power to keep the vitality and normal morphology of PC12 cells.

bovine hair;hydrolysate;PC12 cells;oxidative injury;inhibitory effect

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.01.008

2014- 09- 24

國家自然科學基金資助項目 (21276165)；教育部博士點專項基金(20120181110078) 作者簡介：曾維才 (1986—),男,四川敘永人,講師,博士,主要從事廢棄生物質的資源化利用研究工作

TQ35；TQ931

A

1673-5854(2015)01- 0043- 06

*通訊作者：石 碧,男,教授,博士,博士生導師,主要從事蛋白質化學方面的研究工作;E-mail:shibi@scu.edu.cn。