王燕云， 楊 靜

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室,云南 昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224)

·研究報告——生物質(zhì)化學(xué)品·

稀堿-Fenton試劑預(yù)處理對云南苦竹酶水解得率的影響

王燕云1,2， 楊 靜

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省木材膠黏劑及膠合制品重點實驗室,云南 昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué) 材料工程學(xué)院，云南 昆明 650224)

利用響應(yīng)面法對稀堿-Fenton反應(yīng)預(yù)處理竹粉的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的Fenton預(yù)處理條件為：1 g 稀堿預(yù)處理后竹粉底物加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 %的 H2O2溶液3.4 mL，F(xiàn)e2+濃度15.8 mmol/L，反應(yīng)時間12 h，獲得的 72 h 酶水解得率為49.98%。與原料和經(jīng)2%NaOH 預(yù)處理后的樣品相比，經(jīng)2%NaOH-Fenton 預(yù)處理后的樣品中纖維素含量升高，半纖維素和木質(zhì)素含量降低，72 h酶水解得率為48.24%，分別提高了47.79和37.44個百分點。當(dāng)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g(以纖維素質(zhì)量計)時，72 h 酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率提高了22.80%。

響應(yīng)面法；Fenton反應(yīng)；酶水解得率

纖維素乙醇作為一種可再生的能源，其經(jīng)濟(jì)前景和環(huán)境效益越來越受重視[1]。纖維素乙醇的制備主要經(jīng)過原料預(yù)處理、纖維素酶水解、糖液(戊糖、己糖)乙醇發(fā)酵和酒精蒸餾脫水等過程[2]。盡管木質(zhì)纖維生物質(zhì)是地球上最多的碳水化合物，來源廣泛、價格低廉，但其利用也面臨很多挑戰(zhàn)，如木質(zhì)纖維生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、糖苷鍵對纖維素酶的不可及度低、處理過程中可溶性抑制物的形成、混合糖的發(fā)酵效率低等均使得原料預(yù)處理成為限制木質(zhì)纖維素利用的瓶頸。木質(zhì)纖維原料預(yù)處理的主要目的是破壞木質(zhì)纖維的超分子結(jié)構(gòu)，使原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素實現(xiàn)分離，提高纖維素酶對纖維素的可及度，從而提高纖維素的酶水解性能[3]。研究證實預(yù)處理過程的費用占總成本的20%左右[4-5]，因此開發(fā)一種高效率、低能耗、低成本的預(yù)處理方法是當(dāng)前的研究熱點。H2O2與Fe2+催化劑構(gòu)成的氧化體系稱為Fenton試劑，其發(fā)生的氧化反應(yīng)稱為Fenton反應(yīng)(H2O2+Fe2+→H2O+Fe3++·OH)。其本質(zhì)是在Fe2+離子的催化作用下H2O2的分解活化能低(34 kJ/mol)，能夠產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物羥基自由基(·OH)，并依靠羥基自由基氧化分解有機(jī)物。本研究擬建立一種稀堿-Fenton試劑預(yù)處理竹粉的兩段預(yù)處理方法，NaOH能使纖維素潤脹，利于木質(zhì)素的溶出；而Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH使底物中纖維素結(jié)構(gòu)疏松和纖維素三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終達(dá)到提高后續(xù)酶水解效率的目的。

1 實 驗

1.1 材料

云南苦竹(Pleioblastusamarus(Keng)Keng f.)的竹片殘渣來自云南省云景林紙股份有限公司，經(jīng)粉碎，過篩孔直徑0.30～0.45 mm得到竹粉，其化學(xué)組成為：纖維素41.23%、木聚糖22.30%、酸溶木質(zhì)素1.36%、酸不溶木質(zhì)素29.83%、 灰分3.03%。

H2O2(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥30%)，七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，為淡藍(lán)綠色結(jié)晶。所用試劑均為分析純。

里氏木霉纖維素酶和β-葡萄糖苷酶均由丹麥諾維信(Novozyme)公司生產(chǎn)，Sigma 公司提供。里氏木霉纖維素酶的濾紙酶活125 FPIU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活330 IU/mL。

1.2 稀堿預(yù)處理

將竹粉在20 g/L的NaOH 溶液、固液比1∶10(g∶mL，下同)和65 ℃下處理2 h。反應(yīng)結(jié)束，用蒸餾水洗滌固體殘渣，作為Fenton反應(yīng)的底物。

1.3 Fenton反應(yīng)預(yù)處理

取稀堿預(yù)處理后的竹粉1 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% H2O22～4 mL，調(diào)節(jié)Fe2+濃度5.79～15.79 mmol/L，固液比1∶10，并于pH值3.0和16.76 r/s 的條件下反應(yīng)12～36 h。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌固體渣，作為纖維素酶水解反應(yīng)的底物。

1.4 酶水解方法

取絕干質(zhì)量為10 g的預(yù)處理料置于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，溶液pH值為4.8，酶用量為15 FPIU/g(以纖維素質(zhì)量計，下同)。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?0 ℃、150 r/min的搖床中反應(yīng)。分別于2、4、8、12、24、48、72 h取樣，于3 000 r/min下離心10 min，取上清液適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)測定反應(yīng)液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計算纖維素酶水解得率[6-7]。纖維素水解得率(Y)可用下式計算：

Y=(c×V×0.9)/(m×w)×100%

式中：Y—纖維素水解得率，%； c—水解液中葡萄糖和纖維二糖質(zhì)量濃度，g/L；V—水解液體積，L； 0.9—纖維素和葡萄糖之間的轉(zhuǎn)換系數(shù)；m—原料質(zhì)量，g；w—原料中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.5 響應(yīng)面分析方法

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理[8]，綜合前期試驗結(jié)果，選取Fe2+濃度、30%H2O2用量、反應(yīng)時間，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗條件優(yōu)化，采用Design-Expert, Version 7.0軟件進(jìn)行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析。

1.6 分析方法

1.6.1 水分含量的測定 水分含量的測定采用紅外線水分計FD-720測定。

1.6.2 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定 樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的組成按美國可再生能源實驗室公布的方法測定[9]。

1.6.3 酶水解液中糖組分的測定 采用高效液相色譜(HPLC, Agilent technology 1100 series, Palo Alto, CA)法測定酶水解液中的糖組分。酶水解后的上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，以0.005 mol/L 的硫酸作為流動相，流速為0.6 mL/min，在示差折光檢測器(RI)上進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗及結(jié)果分析

綜合前期試驗的結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 7.0 軟件，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，以酶水解得率為響應(yīng)值，選擇30% H2O2用量(X1)、Fe2+濃度(X2)和反應(yīng)時間(X3)為變量，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計共有17 個試驗點，其中12 個為分析因子，5 個為零點，零點試驗用作誤差估計。對表1試驗得到的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到以酶水解得率為目標(biāo)函數(shù)的二次多元回歸方程：Y=48.22+1.58X1+1.62X2+0.66X3+0.20X1X2+0.23X1X3-1.23X2X3-1.17X12-0.92X22+0.52X32回歸方程中，各項系數(shù)的絕對值大小反映了各因素對酶水解得率的影響程度。由該方程可知，對酶水解得率的影響順序由大到小為：Fe2+濃度、H2O2用量、反應(yīng)時間。對上述回歸模型進(jìn)行方差分析以檢驗方程的有效性，方差分析結(jié)果見表2。

表2 回歸模型方差分析

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著程度由F檢驗判定，模型P值小于0.000 1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.050 0，表明該模型具有較高的顯著水平；且相關(guān)系數(shù)R2=97.96%，說明響應(yīng)值的變化有97.96%來源于所選3個變量，即30% H2O2用量，F(xiàn)e2+濃度和反應(yīng)時間。失擬差項P值為0.055 7且大于0.050 0,表明失擬差項不顯著，試驗?zāi)Ｐ偷氖M度好?？梢杂迷撃Ｐ蛯嶒灲Y(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。

對因素X1、X2、X3及其交互項X1X2、X1X3、X2X3進(jìn)行分析，一次項X1、X2和X3的P值均小于0.050 0，表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2，F(xiàn)e2+濃度和反應(yīng)時間這3個變量對酶水解得率的影響都具有較高的顯著性；二次項X12，X22，X32的P值也都小于0.050 0，說明質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2，F(xiàn)e2+濃度和反應(yīng)時間都具有較高的顯著性，對響應(yīng)值的影響相對復(fù)雜，具有顯著的曲面效應(yīng)；交互項X2X3的P值小于0.050 0，說明Fe2+濃度和反應(yīng)時間的交互影響顯著。

利用模型確定最佳的酶水解條件為30% H2O23.36 mL，F(xiàn)e2+濃度15.79 mmol/L，反應(yīng)時間12 h，預(yù)測在該條件處理下的酶水解得率為50.53%。圖1是各個變量相互之間的響應(yīng)面曲線圖，每個圖表示的是當(dāng)一個變量為編碼零水平時其他兩個變量的相互作用對響應(yīng)值的影響[10]。

圖1 響應(yīng)曲面圖

由圖1可以看出質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2用量、Fe2+濃度和反應(yīng)時間這3個變量對酶水解得率的影響程度。在圖1(a) 中，F(xiàn)e2+濃度對酶水解得率的影響程度大于質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2；圖1(b)顯示Fe2+濃度對酶水解得率的影響程度大于反應(yīng)時間；圖1(c) 可以看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2對酶水解得率的影響程度大于反應(yīng)時間。由此可知，各因素對酶水解得率的影響程度為：Fe2+濃度>H2O2用量>反應(yīng)時間。

2.2 驗證實驗

為檢驗響應(yīng)面結(jié)果的有效性，在1 g預(yù)處理后竹粉中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶液3.4 mL，F(xiàn)e2+濃度15.8 mmol/L，反應(yīng)時間12 h的條件下進(jìn)行了3組平行的驗證試驗，酶水解得率分別為49.35%、49.87%和50.73%,平均值為49.98%。實驗說明該回歸方程與實際實驗有較好的擬合度，證明響應(yīng)面優(yōu)化法得到的最佳參數(shù)是合理的。

2.3 NaOH-Fenton預(yù)處理對化學(xué)組分及酶水解得率的影響

為了解兩段預(yù)處理方法對樣品化學(xué)組成的影響，分別測定了3種樣品的化學(xué)組成；并且在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，pH值4.8,50℃，攪拌速度150 r/min，纖維素酶用量15 FPIU/g的條件下水解72 h，結(jié)果如表3所示。

表3 3種樣品的化學(xué)組成和酶水解得率

木質(zhì)纖維原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間形成的致密結(jié)構(gòu)不利于纖維素酶與纖維素的接觸，因此木質(zhì)纖維原料在纖維素酶水解前必須經(jīng)過預(yù)處理。稀堿預(yù)處理有利于斷裂木質(zhì)素、纖維素和半纖維素之間的酯鍵連接，溶出木質(zhì)素，同時對纖維素進(jìn)行潤脹，降低纖維素的結(jié)晶度，從而提高原料中纖維素酶對纖維素的可及度，促進(jìn)后續(xù)的酶水解作用。Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有較強(qiáng)的氧化性，可奪取葡萄糖單體上的羥基的電子，使其氧化為醛基，從而使底物中纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)疏松，最終達(dá)到提高后續(xù)酶水解效率的目的。由表3可知，與原料相比，經(jīng)2% NaOH 預(yù)處理后的樣品中木質(zhì)素含量降低，纖維素含量升高，72 h酶水解得率10.80%比原料的0.45%提高了10.35個百分點。經(jīng)2% NaOH-Fenton 預(yù)處理后的樣品中半纖維素含量比原料和經(jīng)2% NaOH 預(yù)處理后的樣品中減少了50%左右，纖維素含量增加。72 h酶水解得率為48.24%，分別比原料和經(jīng)2% NaOH 預(yù)處理后的酶水解得率提高了47.79和37.44個百分點。由此可知，把稀堿-Fenton反應(yīng)用于原料的預(yù)處理可以明顯破壞木質(zhì)纖維原料的結(jié)構(gòu)，降低木質(zhì)素和半纖維素的含量，提高纖維素與纖維素酶之間的接觸，從而提高酶水解得率。

2.4 酶用量對酶水解得率的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，pH值4.8,50 ℃，攪拌速度150 r/min，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量比為2∶1，最大纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g，并且在響應(yīng)面優(yōu)化得出的最佳Fenton條件下，稀堿-Fenton試劑預(yù)處理后的竹粉水解72 h，結(jié)果如表4 所示。

表4 酶用量對酶水解得率的影響

由表4 可知，酶水解得率隨著纖維素酶用量的增加而增加，但當(dāng)酶用量達(dá)到一定值后，酶水解得率增加幅度變小，當(dāng)纖維素酶用量為20 FPIU/g時，72 h的水解得率為55.86%。纖維素酶為一復(fù)合酶系，主要由內(nèi)切型(β-1，4)葡聚糖酶、外切型(β-1，4)葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成[11]。在纖維素酶水解纖維素的過程中，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶受不斷增加的纖維二糖抑制，而β-葡萄糖苷酶對葡萄糖的累積更敏感，但對于整個纖維素酶系來說，纖維二糖的抑制作用強(qiáng)于葡萄糖。里氏木霉是目前公認(rèn)的最有工業(yè)應(yīng)用前景的可用于木質(zhì)纖維原料糖化的纖維素酶生產(chǎn)菌株，而里氏木霉自身β-葡萄糖苷酶分泌量的不足可通過外源添加β-葡萄糖苷酶的輔助方式實現(xiàn)對纖維素的高效水解。在一定的范圍內(nèi)，糖化率隨著體系中β-葡萄糖苷酶活力的增加而增加，當(dāng)β-葡萄糖苷酶活力增加到一定程度后，糖化程度就基本趨于恒定。采用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量比2∶1，從表4 可看出，添加外源β-葡萄糖苷酶后，纖維素酶水解得率均有大幅度的提高，當(dāng)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g時，酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率62.41%提高了22.80%。添加外源的β-葡萄糖苷酶后，商品酶和自產(chǎn)酶的酶系結(jié)構(gòu)趨于合理，β-葡萄糖苷酶與內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的協(xié)同作用較好，纖維素酶的整體水解效率提高。

3 結(jié) 論

3.1 利用響應(yīng)面法優(yōu)化稀堿-Fenton試劑預(yù)處理竹粉的條件，得到最佳的Fenton預(yù)處理條件為： 1 g稀堿預(yù)處理后竹粉底物加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶液3.4 mL， Fe2+濃度15.8 mmol/L，反應(yīng)時間12 h，獲得的酶水解得率為49.98%。

3.2 與原料和經(jīng)2% NaOH 預(yù)處理后的樣品相比，經(jīng)2% NaOH-Fenton 預(yù)處理后的樣品中纖維素含量升高，半纖維素和木質(zhì)素含量降低，72 h酶水解得率為48.24%，分別提高了47.79和37.44個百分點。

3.3 當(dāng)纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的用量分別為32 FPIU/g和16 IU/g(以纖維素質(zhì)量計)時，72 h酶水解得率為76.64%，比單獨使用纖維素酶時的酶水解得率提高了22.80%。

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《林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)》(雙月刊，1981年創(chuàng)刊)，由中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所、中國林學(xué)會林產(chǎn)化學(xué)化工分會共同主辦，為全國林產(chǎn)化工行業(yè)的學(xué)術(shù)類期刊。報道范圍是可再生的木質(zhì)和非木質(zhì)生物質(zhì)資源的化學(xué)加工與利用，研究領(lǐng)域為生物質(zhì)能源、生物質(zhì)化學(xué)品、生物質(zhì)新材料、生物質(zhì)天然活性成分和制漿造紙等，主要包括松脂化學(xué)、生物質(zhì)能源化學(xué)、生物質(zhì)炭材料、生物基功能高分子材料、膠黏劑化學(xué)、森林植物資源提取物化學(xué)利用、環(huán)境保護(hù)工程、木材制漿造紙為主的林紙一體化和林產(chǎn)化學(xué)工程設(shè)備研究設(shè)計等方面的最新研究成果。

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Influence of Alkaline-Fenton Pretreatment on the EnzymaticHydrolysis Yield of Yunnan Bamboo

WANG Yan-yun1,2, YANG Jing1,2

(1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Wood Adhesives and Glued Products,Southwest Forestry University， Kunming 650224,China； 2.College of Materials Science and Engineering,Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The optimum reaction conditions of alkaline-Fenton pretreatment of bamboo were obtained through the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions of Fenton reaction were alkaline treated bamboo 1 g, 30% H2O23.4 mL, concentration of Fe2+15.8 mmol/L, and reaction time 12 h. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 49.98%. The sample pretreated by 2% NaOH-Fenton had higher cellulose content and lower hemicellulose and lignin content compared with the materials and sample pretreated by 2% NaOH. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 48.24% and increased by 47.79% and 37.44%, respectively. The 72 h enzymatic hydrolysis yield was 76.64% when the dosage of the cellulase and theβ-glucosidase were 32 FPIU/g and 16 IU/g, respectively. This was 22.80% higher than that with the single use of the cellulase 32 FPIU/g.

response surface methodology; Fenton reaction; enzymatic hydrolysis yield

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.004

2015- 05- 25

國家自然科學(xué)基金資助項目(31260162)

王燕云(1991—),女，江蘇蘇州人，碩士生，研究方向為生物質(zhì)能源

*通訊作者：楊 靜(1976—)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事木質(zhì)纖維素的生物降解與轉(zhuǎn)化的研究；E-mail:kmjingyang@163.com 。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0017- 06