李文華　劉增香　羅金鳳

中山大學附屬第五醫(yī)院　1檢驗科　2兒科　3 設(shè)備科，廣東省珠海市　519000

?

(編輯紫蘇)

隱球菌性腦膜炎腦脊液四種檢測方法的比較

李文華1劉增香2羅金鳳3

中山大學附屬第五醫(yī)院1檢驗科2兒科3 設(shè)備科，廣東省珠海市519000

新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)是存在于自然界土壤和鴿子等鳥類糞便中的一種真菌，它可以經(jīng)呼吸道進入人體后產(chǎn)生一種胞外酶脂酶B，破壞肺泡中的表面活性物質(zhì)，在肺內(nèi)形成病灶，數(shù)月后經(jīng)血行播散到腦或腦膜，引起新型隱球菌性腦膜炎(Cryptococcus meningitis,CM)。近年來隨著環(huán)境污染的增加，機體免疫缺陷患者大量增加，大量激素和抗生素的不合理使用，使CM發(fā)病呈逐年上升趨勢，全球每年約有957 900人患CM[1]。由于CM臨床表現(xiàn)比較復雜，癥狀不典型，很容易在發(fā)病早期出現(xiàn)誤診或漏診，根據(jù)2010年美國感染病學會最新的隱球菌病臨床指南，如能早期診斷、合理治療，大部分患者是可以治愈的[2,3]。由此可見，對腦脊液中隱球菌的盡早發(fā)現(xiàn)尤為重要，現(xiàn)就臨床上常用的四種檢測方法進行比較分析,報告如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2011年1月—2014年12月我院收治的腦脊液隱球菌PCR陽性患者104例，其中只有98例通過墨汁染色法或真菌培養(yǎng)法找到隱球菌，其中男62例，女36例，年齡3～77歲，平均年齡(43±5.9)歲。

1.2儀器和試劑儀器：培養(yǎng)采用德國Hera公司生產(chǎn)CO2培養(yǎng)箱，奧林巴斯CX21顯微鏡，北京白洋醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的BY320型離心機。試劑：印度墨汁，新型隱球菌乳膠凝集試劑由美國IMMY公司生產(chǎn)，沙保羅培養(yǎng)基干粉從杭州生物公司購得，真菌鑒定用法國公司API20Aux試劑，PCR試劑由上海重工生化工程公司提供。

1.3方法

1.3.1腦脊液涂片墨汁染色：取腦脊液3ml左右，400g/min離心15min，棄上清液，取沉淀物一小滴涂片，再取印度墨汁一小滴，混合后加蓋玻片，先用低鏡觀察，發(fā)現(xiàn)黑色中有圓形透明可疑小點再轉(zhuǎn)成高鏡確認，鏡下可見細胞，是圓形雙層結(jié)構(gòu)，壁厚，透明莢膜包裹著菌細胞，菌體大小可不一，即為隱球菌墨汁染色陽性。

1.3.2真菌培養(yǎng)法：取腦脊液50μl直接涂抹于沙氏培養(yǎng)基上，放于35℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72h，在沙保羅上挑取圓形、光滑、奶油樣白色菌落2~3個進行，用API20Aux做鑒定，根據(jù)鑒定為新型隱球菌。

1.3.3乳膠凝集法：取腦脊液3ml在100℃水中水浴5min冷卻備用，取25μl原液與25μl乳液試劑混合3min看結(jié)果，判斷標準同說明書，陰性結(jié)果和陽性結(jié)果必須達到要求方能報告。

1.3.4PCR擴增法：取新鮮腦脊液200μl,7 000g/min離心5min后棄去上清液，在剩余的沉淀物中加堿性裂解液0.5ml，98℃10min后,再予7 000g/min離心5min后，取上清液做試驗模板，然后按照試劑操作說明書加入緩沖液、引物、模板及Tag DNA聚合酶,用無菌石蠟油覆蓋，進入到PCR循環(huán)，循環(huán)為95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，32個循環(huán)，最后72℃延伸5min，PCR擴增產(chǎn)物用2g/L瓊脂糖凝液電泳，100V 30min，在紫外線燈下觀察結(jié)果，出現(xiàn)特異性條帶為隱球菌陽性。

2結(jié)果

按照新型隱球菌腦膜炎診斷標準，結(jié)合臨床癥狀、體征、腦脊液常規(guī)及生化檢查異常等情況，腦脊液新型隱球菌PCR結(jié)果為陽性的104例中，通過腦脊液涂片墨汁染色或者真菌培養(yǎng)法找到新型隱球菌共98例，即臨床確診的隱球菌感染為98例，四種方法的檢測時間和陽性率見表1；四種方法的符合率見表2；四種方法符合例數(shù)的卡方比較見表3。

表1　四種方法的陽性統(tǒng)計指標

表2　四種方法的符合率比較(n)

表3　四種方法符合例數(shù)的卡方比較

注：*P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。

3討論

墨汁染色法是各實驗室最簡單、方便且易開展的方法，由表1、表2可以看出,墨汁染色法與其他三種方法相比，它的陽性率和符合率最低，一方面，在發(fā)病早期隱球菌數(shù)量較少；另一方面，隱球菌主要集中在腦膜或腦室脈絡(luò)叢肉芽腫細胞內(nèi)，穿刺部位對檢出率會有影響。如果穿刺腦脊液時混入血細胞，也會影響隱球菌的檢出率。而且隨著病程進展，大量抗真菌藥物的使用，使治療后的隱球菌出現(xiàn)退形變，有透明的莢膜，在高倍鏡下不易看清或難以辨認。本次統(tǒng)計直接涂片墨汁染色法陽性率和符合率分別是75.00%和79.59%，仍有20.41%(20/98)未檢出，與文獻[4]報道80%陽性率一致，故本方法不利于早期診斷。真菌培養(yǎng)法一直是診斷隱球菌感染的金標準，本方法特異性高，一旦查出就可確診，但其敏感性并沒有PCR方法高。本次統(tǒng)計中仍有6例涂片可見隱球菌但培養(yǎng)陰性，可能與菌量少難以在平板上形成菌落有關(guān)，與接種量較少也有一定關(guān)系；同時也可能因大劑量使用抗真菌藥物，使腦脊液標本因藥物作用抑制了隱球菌的生長，使培養(yǎng)呈現(xiàn)假陰性結(jié)果；真菌培養(yǎng)法的培養(yǎng)時間是四種方法中最長的，平均需要73h，是四種方法中最慢出報告的，因此也不利于CM的早期診斷。乳膠凝集法的陽性率和符合率分別為91.35%和96.94%，與文獻報道[5]90.9%的陽性率相一致，可作為早期診斷隱球菌感染非常好的方法。由于本次的病例符合CM診斷特征(臨床病狀、體征、腦脊液常規(guī)生化檢查異常)，且PCR方法為隱球菌陽性的病例，并未統(tǒng)計乳膠凝集法中非隱球菌感染患者的假陽性問題，這方面統(tǒng)計有待研究。有文獻報道，腦脊液做適當稀釋可以避免乳膠凝集法假陽性的產(chǎn)生[6]。另外，風濕因子存在也可出現(xiàn)假陽性結(jié)果；在隱球菌感染早期，或者高滴度的前帶影響等情況下，乳膠凝集法會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[7]。PCR方法檢測腦脊液隱球菌的陽性率和符合率分別是100.00%和94.23%，在四種方法中陽性率最高，符合率僅次于乳膠凝集法，而且檢測時間短，操作快速簡便[8]。此次統(tǒng)計中，PCR方法陽性共104例，但臨床確診只有98例，即6例存在假陽性，假陽性率為5.77%，盡管如此，它在早期診斷方面仍然具有非常大的優(yōu)勢。

從表3可以看出，真菌培養(yǎng)法、乳膠凝集法、PCR法分別與墨汁染色法的符合率相比較，均有顯著性差異(P<0.05)，說明這三種方法的符合率明顯高于傳統(tǒng)的墨汁染色法。符合率較高的PCR方法與乳膠凝集法相比較，符合率差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明這兩種方法的符合率差異不大。

由此可見，墨汁染色法陽性率和符合率低，不適合早期診斷；真菌培養(yǎng)法特異性好，一直是診斷的“金標準”，但敏感性有限，報告時間也長；抗原乳膠凝集法的特異性和敏感性高，但容易出現(xiàn)假陽性；PCR法特異性、敏感性高，但也有5.77%的假陽性。在CM早期，乳膠凝集法和PCR法作為診斷隱球菌性腦膜炎有無可替代的優(yōu)勢，為患者贏得治療時間，同時結(jié)合培養(yǎng)法進一步確診；在治療中可以選擇乳膠凝集法、墨汁染色法來觀察隱球菌多少來初步判定藥物治療的療效；在治療數(shù)月和恢復期，也可以結(jié)合乳膠凝集法、PCR、真菌培養(yǎng)法和墨汁染色法來評價患者恢復狀況，總之，四種方法各有優(yōu)缺點，互相補充，為臨床更好地發(fā)現(xiàn)和治療CM發(fā)揮重要的作用。

參考文獻

[1]Park BJ,Wannemuehler KA,Marston BJ,etal. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS 〔J〕.AIDS,2009,23(4):525.

[2]Saha DC,Xess I,Biswas A,etal. Detection of Cryptococcus by conventional,Serological and molecular methods 〔J〕. Med Microbiol,2009,58(8):1098-1105.

[3]Perfect JR,Dismukes WE,Dromer F,etal. Clinical Practice guidelines for the management of cryptococcal disease :2010 up-date by the infection disease society of America〔J〕. Clin Infect Dis,2010,50(3):391-322.

[4]李京紅，張國俊. 新型隱球菌腦膜炎腦脊液的檢測方法探討〔J〕.中國實用神經(jīng)疾病雜志,2009,8(11):85-87.

[5]何艷群,田敬華,華文浩，等. 53例艾滋病合并隱球菌性腦膜炎腦脊液檢測分析〔J〕.北京醫(yī)學,2012,34(6):459-461.

[6]王欣，張倫理，郭彥,等.新型隱球菌檢測方法的比較及臨床應(yīng)用〔J〕.中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2013,23(5)：1180-1182.

[7]班立芳，孔慶飛，王勇鳴,等.新生隱球菌性腦膜炎的腦脊液標本檢驗方法分析〔J〕.中國醫(yī)藥科學,2012,2(8):83-84.

[8]韓慧，胡子有，吳炳義,等.熒光定量PCR和環(huán)介導等溫擴增方法檢測隱球菌CAP10基因的比較研究〔J〕.南方醫(yī)科大學學報,2012,32(6):817-820.

(編輯落落)

摘要目的：比較隱球菌性腦膜炎患者腦脊液中檢測隱球菌四種方法的優(yōu)缺點。方法：分別采用墨汁染色法、真菌培養(yǎng)法、隱球菌抗原乳膠凝集法、聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)檢測腦脊液中的新型隱球菌屬。結(jié)果:墨汁染色法、真菌培養(yǎng)法、乳膠凝集法、PCR法四種方法的陽性率和符合率分別是75.00%與79.59%、84.62%與89.80%、91.35%與96.94%、100.00%與94.23%；墨汁染色法陽性率和符合率低，不適合早期診斷；真菌培養(yǎng)法特異性好，但敏感性低，報告時間長；乳膠凝集法的特異性和敏感性高，但容易出現(xiàn)假陽性；PCR法特異性、敏感性高，但也有5.77%的假陽性。真菌培養(yǎng)法、乳膠凝集法、PCR法的符合率明顯高于墨汁染色法。結(jié)論:四種方法各有優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)臨床病程靈活選擇。

關(guān)鍵詞隱球菌性腦膜炎腦脊液檢測方法 R446

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)15-1971-03

Comparison of Four Methods for Detection of Cryptococcal Meningitis Cerebrospinal Fluid

LI Wenhua*，LIU Zengxiang， LUO Jinfeng.*DepartmentofLaboratory，theFifthHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity，ZhuhaiCity，GuangdongProvince519000

ABSTRACTObjective：To compare the detection of Cryptococcus in cerebrospinal fluid in the patients with Cryptococcus meningitis and the advantages and disadvantages of the four methods. Methods：Use the ink staining method,fungi culture method,Cryptococcus antigen latex agglutination method and the method of polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptococcus neoformans in CSF. Results：Ink staining method and fungi culture method,latex agglutination method,PCR method,four methods of positive rate and the coincidence rate is 75.00% and 79.59%, 84.62% and 89.80%,91.35% and 96.94%， 100.00% and 94.23% respectively. Ink staining positive rate and the coincidence rate is low,not suitable for early diagnosis; fungi culture method specificity,but low sensitivity,and use a long time to report. Antigen latex agglutination method,high specificity and sensitivity,but easy to produce false positive results; PCR method specificity,high sensitivity,5.77% false positive .The coincidence rate of culture method and latex agglutination method and PCR method was significantly higher than that of the ink staining method. Conclusion：The four methods have their advantages and disadvantages,and we should choose them according to the clinical course need.

KEY WORDSCryptococcus meningitis,Cerebrospinal fluid,Detection method

收稿日期2015-03-29