許建婷，金浩范，王冀邯，牛　超，高長曌，王國慶，李　凡*

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021)

基于分子互作網絡的MMPs相關基因在胃癌組織中的表達研究

許建婷1,2，金浩范2，王冀邯1，牛超2，高長曌1，王國慶1，李凡1*

(1.吉林大學基礎醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0056)

胃癌作為臨床常見的消化道惡性腫瘤，多年來困擾著我國的國民健康[1]。早期檢出率低是胃癌死亡率居高不下的關鍵原因，往往被診斷出中晚期的病例已伴隨著癌細胞的廣泛侵襲及遠處轉移，直接否決了手術根治的可能性[2]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族因其能夠降解細胞基底膜和基質、突破細胞外基質屏障，被認為與細胞的侵襲、擴散、轉移等過程直接相關[3]。已有研究顯示胃癌中部分MMPs家族成員表達異常，然而單個甚至數個分子并不能系統(tǒng)的詮釋胃癌的發(fā)展機制。作為酶類蛋白質，MMPs往往通過與其相關基因、蛋白相互作用，共同參與疾病的發(fā)生發(fā)展。因此全面的基因篩查及分子間相互作用網絡的探索對解釋疾病的發(fā)生發(fā)展至關重要。本研究以胃癌組織高通量芯片為信息基礎，整合BioGRID[4]數據庫信息，構建了胃癌組織中MMPs家族相關的分子互作網絡，旨在為胃癌的侵襲、轉移研究提供更多的分子學機制。

1材料與方法

1.1　標本采集

研究選取2012年5月至2013年5月吉林大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科收治入院、經病理檢測確診為胃癌的患者10例，術前未行放化療措施。年齡48-71歲，平均年齡57.6歲，男性6例，女性4例。分別選取癌癥病灶組織及相應距病灶>5 cm以上的癌旁組織(視為正常對照組)，所有標本均在術后10 min內置于液氮凍存。

1.2　組織總RNA提取及芯片實驗

運用Trizol法(Invitrogen,USA)提取組織總RNA。用紫外分光管度計(NanoDrop,USA)檢測總RNA濃度及純度，甲醛變性凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，選取符合OD260/OD280值在1.8-2.0之間、條帶完整的RNA樣本進行芯片實驗。調整RNA樣本濃度至1 μg/μl進行逆轉錄，進而進行生物素標記cRNA的合成、純化、片段化，以1μl體積的片段化cRNA進行芯片雜交過程。運用GCOS(GeneChip○ROperating Software)軟件進行芯片掃描，基因芯片顯著性分析(Significant Analysis of Microarray,SAM)法篩選胃癌組織的差異表達基因[5]，篩選改變倍數(fold change,FC)>2,P<0.05為差異基因。實驗過程中所用試劑、儀器均來自Affymetrix(Affymetrix,USA)公司。

1.3　蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡的構建及功能注釋

以胃癌中差異表達基因為研究基礎，選取Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)在線工具獲取蛋白質-蛋白質相互作用關系。篩選的設定：軟件物種來源限定為Homo sapiens，檢索渠道by gene。運用DAVID數據庫[6]進行GO及Pathway注釋。

2結果

2.1　組織總RNA提取及芯片掃描初始結果

運用Trizol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計測得RNA樣本A260/A280比值在1.8-2.0之間，甲醛變性凝膠電泳檢測RNA條帶完整，如圖1所示。將濃度、純度及完整性良好的RNA樣本進行芯片雜交、掃描，所得掃描初始圖如2所示。

2.2　胃癌組織差異基因的表達分析

N：癌旁組織，C：癌癥組織

N：癌旁組織，C：癌癥組織

芯片掃描共得到1666個差異基因(fold change>2，P<0.05)，其中1540個在胃癌組織中呈高表達，126個呈低表達。結果顯示MMP家族多個成員在胃癌組織中均呈高表達狀態(tài)，詳細的基因差異表達倍數改變見表1。

2.3　MMPs及其相關分子互作網絡的構建與功能分析

將BioGRID數據庫中分子互作關系與基因芯片結果整合，得到胃癌組織中表達失調的MMPs相關分子互作網絡，如圖3所示，網絡中18基因在胃癌組織中表達活躍(表1所示)。此18個基因參與了重要的生物學過程(GO-BP)及調控通路(Pathway)，如圖4所示。其中富集程度最顯著的GO條目是細胞外基質的分解、細胞外組分分解等生物過程，富集程度最顯著的Pathway條目是ECM-受體的相互作用、黏著斑等通路，以上的生物過程及通路也是與癌癥的侵襲、轉移過程密切相關的[7,8]。

BioGRID中MMPs相關的蛋白質相互作用網絡圖。紅色圓圈為胃癌組織中高表達基因(P<0.05)

圖3胃癌組織中失調的MMPs家族蛋白質-蛋白質

相互作用網絡

A:GO富集; B:Pathway富集。橫坐標為條目顯著性p-value的-log2值，縱坐標為GO及Pathway條目名稱。

GenesFoldChangeLog2FCMMP17.112.83MMP103.501.81MMP124.172.06MMP132.031.02MMP142.641.40MMP22.231.16MMP37.782.96MMP74.922.30ITGA23.031.60LUM4.762.25COL1A14.662.22LCN22.691.43OSBPL102.081.06TGFB12.061.04THBS24.502.17TIMP14.472.16BRCA13.691.43CD442.061.04

Fold Change為基因的差異改變倍數，Log2FC為Fold Change(FC)的log2值。

3討論

細胞外基質是細胞侵襲、轉移的重要屏障成分，基質金屬蛋白酶家族MMPs可以降解細胞基底膜及外基質中蛋白組分，因此促進了惡性腫瘤的浸潤、轉移過程。相關研究報道了MMP1[9],MMP2[10],MMP7[11],MMP11[12]等多個MMPs成員在胃癌及其它癌癥中表達上調。我們通過組織基因掃描發(fā)現MMPs多個基因在胃癌組織中呈高表達狀態(tài)，其中MMP3及MMP1上調最為明顯(表1)。

分子相互作用網絡分析有助于為疾病的發(fā)生發(fā)展提供較為系統(tǒng)的分子學機制。BioGRID數據庫提供了已發(fā)表文獻證實的和預測的蛋白質相互作用關系，將數據庫中的蛋白互作信息與前期基因芯片的差異表達相結合，得到胃癌組織中存在差異表達的MMPs相關的蛋白互作網絡，網絡中18個分子在胃癌組織中呈高表達狀態(tài)，且其參與的主要的分子功能及通路和癌癥的侵襲、轉移過程密切相關，體現了MMPs及相關基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。

隨著技術的不斷發(fā)展，高通量組學數據及相應的在線軟件、分析工具等為生物醫(yī)學提供了廣泛的信息篩選平臺[13]。通過對所選基因的功能及通路注釋，往往能夠得到與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關的分子學機制，這些信息有助于我們更好的理解已知的基因或者蛋白的作用，也能夠指導研究者尋找出更多未知功能的潛在分子靶標。本文在以上研究思路的指引下，獲得了與胃癌侵襲、轉移過程密切相關的MMPs參與的分子互作網絡，為后續(xù)研究提供了較為全面的分子學機制基礎。

參考文獻：

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摘要：目的探討MMPs相關分子互作網絡在胃癌組織中的表達情況。方法運用10對胃癌及相應癌旁組織芯片篩選胃癌組織中差異表達基因，結合BioGRID數據庫，構建胃癌組織中表達異常的MMPs相關分子互作網絡。結果胃癌中多個MMPs家族成員及其互作網絡中的18個基因均呈高表達狀態(tài)，主要參與的生物學過程及通路和癌癥細胞的侵襲、轉移等過程密切相關。結論高通量組學及相關數據庫、分析工具的結合有助于構建癌癥中表達異常的分子互作網絡，為后續(xù)的研究提供較全面的分子學機制基礎。

關鍵詞：分子互作網絡；MMPs；BioGRID數據庫；GO；Pathway

Expression analysis of MMPs and their related genes based on the molecular interaction network in gastric cancer tissuesXUJian-ting,JINHao-fan,WANGJi-han,etal.(CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues.Methods10 pairs of gastric cancer and their corresponding para-carcinoma tissues were analyzed with microarray for screening of the differentially expressed genes,then constructed the differentially expressed MMPs-related molecular interaction network in gastric cancer tissues by integrating the information from BioGRID databases and the microarray results.Results18 genes in the MMPs-related molecular interaction network (also including several MMPs members) were up-regulated in gastric cancer tissues,the main biological processes and pathways that they participated in were closely related with cancer invasion and metastasis progression.ConclusionThe combination of high-throughput genomics,bioinformatic databases and analytical tools is necessary for the analysis of cancer-related molecular interaction network,which will provide more comprehensive molecular mechanisms for the future research.

Key words:molecular interaction network;MMPs;BioGRID;GO;Pathway

收稿日期：(2013-12-11)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R735.2

文章編號：1007-4287(2015)01-0056-04

通訊作者*