孫牧男，劉　磊，馬寅芙，許淑芬，方艷秋，譚　巖

(吉林省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021)

CXCL12/CXCR4在小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)及臨床意義

孫牧男，劉磊，馬寅芙，許淑芬，方艷秋，譚巖*

(吉林省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0050)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，其中小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一種惡性程度較高的肺癌[1,2]，在肺癌中所占的比例約20%-25%。小細(xì)胞肺癌惡性程度高，倍增時(shí)間短，轉(zhuǎn)移早而廣泛，對(duì)化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復(fù)發(fā)[3,4]。

CXCL12又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是小分子的細(xì)胞因子，屬于趨化因子蛋白家族。CXCL12及其受體CXCR4的生理功能主要是介導(dǎo)免疫和炎性反應(yīng)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12/CXCR4還與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5,6]。

本研究通過(guò)檢測(cè)SCLC患者手術(shù)前外周血中CXCL12含量及組織中CXCL12/CXCR4的表達(dá)，探討了CXCL12/CXCR4與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系及其在SCLC進(jìn)展中的作用。

1材料與方法

1.1　研究對(duì)象

收集吉林省人民醫(yī)院初次住院的SCLC患者62例，其中男性50例、女性12例，年齡42-68歲，平均年齡57歲；局限期(Limited stage disease，LD)患者30例，擴(kuò)散期(Expensive stage disease，ED)患者32例。所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療，術(shù)后均獲得病理確診。另外選擇10例良性肺部腫瘤患者作為對(duì)照組，男性7例、女性3例，年齡35-66歲，平均年齡53歲，均排除各臟器病變，無(wú)感染性疾病等。

1.2　標(biāo)本采集

采用真空干燥采血管分別抽取受檢者手術(shù)前清晨空腹靜脈血10 ml和健康志愿者清晨空腹靜脈血10 ml，真空干燥采血管中血樣于室溫下自然凝集30 min，3 500×g 離心15 min，分離血清，置于-20℃冰箱中保存待檢。手術(shù)中收集原發(fā)性肺癌切除標(biāo)本，5倍體積RNA later保存于-80℃冰箱。

1.3　試劑和儀器

人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1β(SDF-1β/CXCL12)ELISA試劑盒購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；RNA later保存液購(gòu)于美國(guó)安捷倫公司；鼠抗人CXCL12、CXCR4抗體及兔抗鼠二抗均購(gòu)于Sant Cruz公司。

1.4　方法

1.4.1ELISA 方法檢測(cè)SCLC患者血清CXCL12水平，嚴(yán)格按照CXCL12檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提供的方法，向96孔板中分別加入CXCL12抗體，密封4℃過(guò)夜，次日用洗滌緩沖液洗滌3次，封閉液封閉后向孔板中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測(cè)樣品10 μl，室溫下孵育后用CXCL12抗體檢測(cè)，洗滌后加入酶標(biāo)試劑50 μl，室溫下孵育45 min，洗滌后加入顯色液，避光顯色15 min，加終止液后測(cè)定A450值。同時(shí)收集10名健康人血清作為對(duì)照。

1.4.2RT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)CXCL12/CXCR4表達(dá)水平 TRIZOL法提取組織中RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增CXCL12和CXCR4，同時(shí)擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參物。CXCL12引物序列為：上游引物5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’,下游引物5’-CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3’；CXCR4引物序列為：上游引物5’-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3’,下游引物5’-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3’；GAPDH引物序列為：上游引物5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’,下游引物5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。將同樣大小肺癌組織及良性對(duì)照組織勻漿，細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以每孔80 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用CXCL12、CXCR4一抗4℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物沒(méi)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，DAB顯色。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，所有檢測(cè)結(jié)果均以 Mean ± SD表示，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1SCLC患者血清CXCL12水平的變化ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，62例SCLC患者血清中CXCL12水平均明顯高于健康對(duì)照組，同時(shí)擴(kuò)散期患者血清中CXCL12含量也高于局限期患者血清中的含量。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)不同分期SCLC患者和健康對(duì)照組血清中CXCL12的含量

2.2ELISA檢測(cè)血清中CXCL12與SCLC患者病理特征的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CXCL12的表達(dá)水平與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡和性別之間的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1)。

表1　SCLC患者及正常對(duì)照組臨床資料分析

*：與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01?！鳎篠CLC組內(nèi)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01。

2.3SCLC患者組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)水平Real-time PCR和Westernblot結(jié)果顯示，62例SCLC患者肺癌組織中CXCL12和CXCR4在轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2采用Real-time PCR和Westernblot方法分別檢測(cè)不同分期SCLC患者和對(duì)照組組織中CXCL12、CXCR4的表達(dá)水平。

3討論

CXCL12 基因定位于人 10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂，能與CXCR4的N端特異性結(jié)合，并與CXCR4結(jié)合后形成CXCL12/CXCR4生物軸，進(jìn)而啟動(dòng)下游信號(hào)通路，在維持胚胎發(fā)育、介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)、調(diào)控造血、誘導(dǎo)血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7,8]。大量研究表明，CXCL12與CXCR4結(jié)合可以調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞增殖，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、惡性黑色素瘤、膀胱癌、食管癌、結(jié)直腸癌以及尤文肉瘤等[9- 16]。

本研究檢測(cè)了SCLC患者血清和組織中CXCL12/CXCR4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SCLC患者血清中CXCL12水平明顯上升，并且擴(kuò)散期SCLC患者與局限期SCLC患者相比具有更高水平的CXCL12。同時(shí)，患者血清中CXCL12的表達(dá)還與腫瘤的大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，這表明，CXCL12/CXCR4可能直接參與了SCLC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲，加劇了腫瘤的病理進(jìn)展，這可能與CXCL12/CXCR4相關(guān)的信號(hào)通路相關(guān)。

CXCL12/CXCR4通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖是通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。CXCL12/CXCR4可以改變G蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而激活應(yīng)激活化蛋白激酶/JNK信號(hào)通路(stress activated protein kinase/Jun-N terminal kinases，SAPK/JNK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2)通路[17-19]。Carmo等[20]發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4可以活化PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，再者，CXCL12可以通過(guò)自分泌和旁分泌方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖[22]。因此CXCL12/CXCR4表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致某些自主細(xì)胞增殖和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，這可能介導(dǎo)了肺癌的惡性發(fā)展。

隨著對(duì)CXCL12及其他趨化因子家族的不斷研究，其在多種免疫病以及腫瘤中的作用得到越來(lái)越廣泛的認(rèn)可。本研究提示CXCL12可以作為提示小細(xì)胞肺癌進(jìn)程的重要分子標(biāo)記，但是其調(diào)節(jié)作用的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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摘要：目的研究小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)患者外周血中CXCL12及其受體CXCR4的表達(dá)情況，探討CXCL12/CXCR4與SCLC發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系。方法采用ELISA、real-time PCR和Westernblot方法，檢測(cè)CXCL12與CXCR4在30例局限期(Limited stage disease，LD)SCLC患者、32例擴(kuò)散期(Expensive stage disease，ED)SCLC患者和10例良性肺部腫瘤患者(對(duì)照組，Control)中的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平，分析CXCL12、CXCR4與SCLC患者臨床病理等指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果CXCL12、CXCR4在SCLC患者組織中均高表達(dá)，其中擴(kuò)散期患者CXCL12、CXCR4表達(dá)平略高于局限期患者組。擴(kuò)散期患者外周血中CXCL12表達(dá)高于其在局限期患者中的水平，二者均高于對(duì)照組。血清中CXCL12水平與患者的性別和年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論CXCL12/CXCR4可能直接或間接參與對(duì)SCLC發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：肺癌；CXCL12；CXCR4

Expression of CXCL12/CXCR4 cells in small cell lung cancer and their clinical significanceSUNMu-nan,LIULei,MAYin-fu,etal.(CentralLaboratory,thePeople’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression levels of CXCL12 and CXCR4 in patients with small cell lung cancer (SCLC),and to investigate the correlation between CXCL12/CXCR4 and the development of human SCLC.MethodsThe serum concentration of CXCL12 was detected by ELISA,and the expression of CXCL12/CXCR4 in tissues were detected by real-time PCR and Westernblot respectively in 30 SCLC patients in limited stage,32 SCLC patients in extensive stage and 10 benign lung cancers (control).Then we analyzed the correlation between CXCL12/CXCR4 and clinical pathological characteristics of SCLC.ResultsThe concentration of serum CXCL12 was higher in patients with limited stage than that in patients with extensive stage,both of them were showed a higher level than that in HC.The expressions of CXCL12/CXCR4 were also higher in SCLC patients than that in HC as well.The serum level of CXCL12 was associated with tumor size and lymphatic metastasis (P<0.01) and had no relations with sex or age of patients (P>0.05).ConclusionThe expression of CXCL12/CXCR4 may participate in regulating the development of SCLC.

Key words:small cell lung cancer; CXCL12; CXCR4

收稿日期：(2013-12-26)

作者簡(jiǎn)介：孫牧男(1983-)，女，碩士研究生，技師，主要研究方向?yàn)槟[瘤生物學(xué)治療。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R734.2

文章編號(hào)：1007-4287(2015)01-0050-04

通訊作者*