杜夏夏，徐鵬

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

弓形蟲病免疫學(xué)診斷方法的研究進展

杜夏夏，徐鵬?

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

弓形蟲病是一種分布廣泛危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，感染后無特征性臨床癥狀，且病原學(xué)檢出率低，而免疫學(xué)檢測具有敏感、快速、便捷等特點，常用的弓形蟲免疫學(xué)診斷方法有ELISA、IHA、MAT等，本文對近年來弓形蟲病免疫學(xué)診斷方法的研究進展作以綜述。

弓形蟲?。幻庖邔W(xué)；診斷技術(shù)

弓形蟲是專性寄生于人與動物有核細胞內(nèi)的寄生性原蟲，1908年，法國人Nicolle、Manceaux在剛地梳趾鼠的肝脾單核細胞中發(fā)現(xiàn)該蟲種，因其滋養(yǎng)體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii），由其引起的疾病稱為弓形蟲病。該病給人畜造成嚴重危害，20世紀70年代豬的無名高熱，其最終禍首就是弓形蟲，豬群患病后表現(xiàn)為高熱稽留（體溫40～42℃）、呼吸困難、咳嗽、腹式呼吸；病豬精神沉郁，結(jié)膜發(fā)紺，皮膚出現(xiàn)紫紅色淤斑，體表淋巴結(jié)特別是腹股溝淋巴結(jié)明顯腫大，身體下部及耳部出現(xiàn)淤血斑或出現(xiàn)較大面積發(fā)紫，有的出現(xiàn)腸炎及神經(jīng)癥狀；孕母豬發(fā)生早產(chǎn)或產(chǎn)出發(fā)育不全的仔豬或死胎。死后剖撿可見肺、肝、脾、淋巴結(jié)、心肌、腦等處均有炎性壞死性變化，顯微鏡下可見有多形性的滋養(yǎng)體，有的在心、腦、骨骼肌等處有休止期的包囊。貓作為弓形蟲的終末宿主，感染后大多呈隱性或亞臨床型經(jīng)過而成為帶蟲者，只有少數(shù)出現(xiàn)臨床癥狀。幼齡貓或機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，可急性發(fā)作，臨床表現(xiàn)為貓的體溫升高，下痢、呼吸困難和肺炎，有的出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。成年貓多為帶蟲者，從糞便排出卵囊，感染其他宿主。

鑒于弓形蟲病大多缺乏特異性臨床癥狀，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，診斷較為困難。而免疫學(xué)診斷具有快速、準確、便捷等優(yōu)點，是目前臨床上常用的輔助診斷方法。弓形蟲病急性期以檢出弓形蟲特異性IgM抗體或弓形蟲循環(huán)抗原[1]作為可靠指標，也可觀察特異性IgG抗體的動態(tài)變化；慢性期以檢測弓形蟲IgG抗體為主。檢測抗弓形蟲抗體或循環(huán)抗原的免疫學(xué)診斷方法主要有薩賓-費爾德曼染色試驗（DT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接血凝試驗（IHA）、間接熒光抗體試驗（IFA）、改良凝集實驗（MAT）、免疫膠體金技術(shù)等。本文對近年來弓形蟲病免疫學(xué)診斷方法的研究進展作以綜述。

1 薩賓-費爾德曼染色試驗（DT）

該方法是弓形蟲病所特有的免疫學(xué)診斷方法，其原理是弓形蟲在與陰性血清作用后仍能被堿性美藍染液深染，但與陽性血清（抗體）作用后則不著色或著色很淡。據(jù)此便可判斷被檢者血清中是否含有弓形蟲抗體。該法的優(yōu)點是特異性強敏感性高，感染后數(shù)天即可出現(xiàn)這種抗體，可用于早期診斷；缺點是所用抗原為活蟲，安全性差，輔助因子較難獲得，因此我國很少使用。

2 凝集試驗

2.1 直接凝集試驗（DTA）該方法的特點是簡便快速，陽性反應(yīng)出現(xiàn)時間比間接血細胞凝集試驗（IHA）早。試驗以甲醛固定的弓形蟲懸液作為抗原與被檢血清直接進行反應(yīng)。在玻片上加不同稀釋度的試驗血清，混勻，幾分鐘后在顯微鏡下觀察，如發(fā)生凝集，則為陽性反應(yīng)。

2.2 改良凝集試驗（MAT）在直接凝集試驗基礎(chǔ)上經(jīng)美國學(xué)者Dubey等的改良和發(fā)展，顯著提高了檢測結(jié)果的敏感性和特異性，并將其稱為改良凝集試驗。該方法基本原理是將待檢血清中的弓形蟲特異性IgG抗體與速殖子表面抗原發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，通過伊文思藍染色，在反應(yīng)孔底部形成放大鏡下可見的蟲體抗原積層。至今，這種檢測方法仍在歐美各國廣泛用于人和動物弓形蟲病的篩查，Dubey將幾種免疫診斷技術(shù)比較后認為MAT是弓形蟲抗體檢測的金標準。

2.3 間接血細胞凝集試驗（IHA）由于抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合而使載體顆粒發(fā)生凝集，稱間接凝集，又稱被動凝集。紅細胞作為一種常見的抗原載體，用紅細胞作為抗原載體的凝集反應(yīng)稱為間接血凝試驗。反應(yīng)原理是：將可溶性抗原致敏于紅細胞表面，用以檢測相應(yīng)抗體，在與相應(yīng)抗體反應(yīng)時出現(xiàn)肉眼可見凝集。其臨床意義在于弓形蟲病的IHA一般在病后1個月左右出現(xiàn)陽性。血清抗體效價1:64為既往感染，1:256可能為近期感染，1:1 024為急性感染。IHA操作簡單，敏感性高，適用于現(xiàn)場檢測，可作為輔助診斷以及流行病學(xué)調(diào)查，缺點是重復(fù)性差，致敏紅細胞不穩(wěn)定。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附試驗是20世紀70年代后期出現(xiàn)的一種標記免疫測定技術(shù)，經(jīng)過不斷的改進和完善，該法已成為十分成熟的免疫學(xué)診斷方法。它具有高度的敏感性和特異性，操作簡便，不需特殊儀器設(shè)備，血樣用量少，判斷結(jié)果容易，現(xiàn)場應(yīng)用方便，是目前符合現(xiàn)場需要的較好的免疫診斷方法。

現(xiàn)目前已開發(fā)出大量的弓形蟲病ELISA診斷試劑盒，主要檢測循環(huán)抗原（CAg）和特異性抗體（IgG、IgM），CAg比特異性抗體出現(xiàn)得更早，因此作為弓形蟲感染的早期檢測指標。特異性抗體的檢測：弓形蟲感染后，血液內(nèi)最早出現(xiàn)的抗體是IgM，可在弓形蟲感染后持續(xù)存在數(shù)周，因此IgM的檢測可作為弓形蟲病的早期診斷。而IgG在感染7 d后出現(xiàn)，但可存在較長時間。但由于IgG在感染者體內(nèi)含量較高，因此易出現(xiàn)假陽性。因此多采用兩種方法相結(jié)合的方式來提高檢測的準確性。

3.1 斑點ELISA斑點ELISA（Dot-ELISA）比常規(guī)ELISA更靈敏、便捷、取材量少，因而迅速被推廣應(yīng)用，在1986年國外已應(yīng)用于弓形蟲病診斷。

3.2 PCR-ELISA 李健等[2]將生物素標記的PCR產(chǎn)物與地高辛標記的特異性探針雜交，再通過酶聯(lián)顯色反應(yīng)測出OD值，以判斷弓形蟲感染情況，用該方法檢測以104、103弓形蟲RH株速殖子腹腔接種小鼠的全血、肝組織，結(jié)果PCR-ELISA方法的檢測閾值為20 fg，其靈敏度是常規(guī)PCR的10倍，并且與人、小鼠瘧原蟲、旋毛蟲等DNA均無交叉反應(yīng)，同一樣本重復(fù)測試5次，一致性良好，檢測感染動物的肝組織及全血標本，104、103組分別在感染后第2天、第3天即可測出陽性，兩種標本的陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異，因此PCR-ELISA是一種快速、高效的測定方法，可應(yīng)用于臨床弓形蟲病的診斷及流行病學(xué)調(diào)查等。

4 免疫膠體金技術(shù)（ICG）

目前，利用膠體金標記技術(shù)診斷弓形蟲病的方法有免疫金銀染色法（IGSS）、快速斑點免疫金滲透法（DIGFA）和膠體金免疫層析法（GICA）。

4.1 免疫金銀染色法（IGSS）免疫膠體金染色法是一種較新的免疫診斷方法，其原理是膠體金探針與相應(yīng)抗原或抗體形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)過銀顯影處理后，使金顆粒周圍吸附大量銀顆粒。由于銀染色對金顆粒之信號有放大作用，所以敏感度很高。

4.2 快速斑點免疫金滲透法（DIGFA）應(yīng)用硝酸纖維素膜（NC膜）作載體的免疫檢測技術(shù)。先將抗原或抗體點于NC膜上，封閉后加待測樣品，洗滌后用膠體金探針檢測相應(yīng)的抗原或抗體，通過金顆粒放大免疫反應(yīng)系統(tǒng)，使反應(yīng)結(jié)果在固相載體NC膜上顯示。并將其裝入充滿吸水材料的滲濾裝置中，裝置分為底和蓋，蓋上一般有直徑為0.5～0.8 cm的小孔。研究表明，該方法特別適合用于間接法檢測抗體或捕獲法檢測IgG。黃菱等[3]建立了便捷、快速的斑點金免疫滲透法檢測腫瘤病患者血清弓形蟲IgG抗體，通過膠體金-SPA直接顯色，陽性者出現(xiàn)紅色斑點。用該法對232名腫瘤病患者血清和260名正常體檢者血清進行檢測，與IHA法對比檢測，其結(jié)果具有良好的一致性。

4.3 膠體金免疫層析法免疫層析技術(shù)是一種將膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)、層析分析技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和新材料技術(shù)等多種方法有機結(jié)合的一種新型診斷技術(shù)。李昕等[4]用膠體金標記弓形蟲單克隆抗體，制成檢測宿主血清中的弓形蟲循環(huán)抗原的膠體金免疫層析試劑條，用其檢測了75份感染弓形蟲速殖子后不同時間小鼠血清中的CAg及30份正常小鼠血清中的抗原，并與ELISA夾心法進行比較。兩種方法檢測高免弓形蟲循環(huán)抗原的符合率為95%，膠體金免疫層析試劑條的靈敏度和ELISA相近。王艷華等[5]利用膠體金標記弓形蟲代謝分泌抗原，利用雙抗原夾心法研制出了弓形蟲抗體金標檢測試劑條，在對弓形蟲陰、陽性血清檢測中，與弓形蟲IHA檢測結(jié)果符合率為82.4%，其中弓形蟲IHA檢測陽性的血清金標試劑條全部為陽性，用金標試劑條檢測人工感染弓形蟲的兔血清，感染后第3天即可檢測到抗體，而用間接血凝診斷試劑檢測，感染后第5天才能檢測到抗體，前者較后者提前2天檢測到抗體。該試劑條法靈敏度明顯高于IHA法，同時具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，適用于弓形蟲病早期檢測和診斷，特別適合在基層推廣應(yīng)用。

為探討3種方法檢測弓形蟲IgG抗體的測試效率，楊亞曉等[6]通過使用金標記、間接血凝試驗（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）的方法檢測全部304個標本的弓形蟲IgG抗體，并對其敏感性、特異性和約登指數(shù)進行了比較。金標記檢測標法、間接血凝試驗（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測弓形蟲IgG抗體的敏感性分別為85.5%、89.8%和91.9%；特異性分別為92.4%、96.6%和97.5%。酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測效率和約登指數(shù)分別94.1%和89%，高于間接血凝試驗（IHA）和金標記的方法。它檢測弓形蟲IgG抗體的敏感性和特異性較高，另外，它可以實現(xiàn)自動化，因此，是適合大型弓形蟲IgG抗體篩查方法。

Khanaliha K1等[7]對基因重組抗原（SAG1、SAG2和SAG3）的診斷作用進行評價，并提供商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附法比較其功效。運用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到JM109菌株的致病性大腸桿菌，并進行表達和純化。SAG1、SAG2和SAG3抗原使用酶聯(lián)免疫吸附試驗系統(tǒng)中不同組的血清和結(jié)果對照那些商業(yè)的IgG和IgM酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。重組表面抗原的抗弓形蟲IgG與商用酶聯(lián)免疫吸附試驗敏感性和特異性檢測結(jié)果如下：SAG1（93.6%和92.9%），SAG2（100.0%和89.4%）和SAG3（95.4%和91.2%），重組SAG2與商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測抗弓形蟲IgG抗體沒有觀察到高度的一致（96.9%）。P22有檢測抗弓形蟲IgM與其他2基因重組抗原的最佳表現(xiàn)。重組SAG1、SAG2和SAG3可全部用于T抗體特異性抗體診斷弓形蟲。并得到ELISA檢測法具有特異性強、靈敏度高等特點。Shirbazou等[8]通過病例對照研究，考察了整體184份血清樣品，包括91例糖尿病和93例非糖尿病患者的健康對照。血清樣本作糖的酶法和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測抗弓形蟲IgG抗體株，得到糖尿病患者和健康對照組弓形蟲IgG抗體的患病率分別為60.43%和38%。糖尿病患者弓形蟲感染的風(fēng)險是健康對照組兩倍高。感染艾滋病毒的患者感染弓形蟲可導(dǎo)致致命的腦炎。診斷主要依靠示范寄生蟲特異性抗體的血清。但艾滋病毒感染者,IgM經(jīng)常檢測不到，然而IgG仍然是探測在大多數(shù)。尿液樣本很容易獲得。Bhattacharyya等[9]研究觀察到艾滋病毒感染患者血清和尿液樣本中的抗弓形蟲IgM和IgG之間無顯著性差異。因此，尿液樣本可代替血清進行弓形蟲病的免疫診斷的研究。

5 展望

弓形蟲病在免疫學(xué)診斷技術(shù)研究方面取得了較大進展，一些研究成果已經(jīng)或正在對弓形蟲病的防控產(chǎn)生重大作用。但目前弓形蟲病免疫學(xué)診斷方面仍然存在一些問題，上述幾種免疫學(xué)檢測方法的敏感性、特異性都有不同的閾值，還有一定的局限性；用于診斷的抗原或抗體純度不夠；很多技術(shù)方法還不夠成熟，只停留在試驗階段，未投入實踐應(yīng)用；目前用于弓形蟲快速檢測的診斷試劑盒數(shù)量少質(zhì)量較差等。綜上所述，開發(fā)新的弓形蟲病診斷方法，把現(xiàn)有的經(jīng)典的免疫學(xué)診斷方法進一步優(yōu)化，這將是未來一段時間研究的方向。目前可根據(jù)現(xiàn)有的診斷資源，選擇多種診斷方法相結(jié)合來提高診斷的特異性和敏感性，從而達到早診斷早確診早治療的目的，把弓形蟲病患病風(fēng)險及危害降到最低。

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[6]楊亞曉，陳玉昆，魏世錦，等.三種方法檢測弓形蟲IgG抗體的效能[J].中國血吸蟲病防治雜志，2014，26（1）：109-110.

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（編輯：張婷婷）

Research progress on immunological diagnosis of Toxoplasma gondii

Du Xiaxia,Xu Peng*

（College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,LiaoningJinzhou121001）

Toxoplasmosis is a widespread serious zoonotic disease withno clinical symptoms after infection,and the low etiology detection rate.Immunological detection possess a sensitive,rapid,and convenient features.Commonly used immunological diagnostic methods include ELISA,IHA, MAT,etc.This papersummarized the recent studies on toxoplasmosis immunological diagnostic methods for reviewed.

Toxoplasmosis;Immunology;Diagnostic techniques

S852.62文獻標識碼：A文章編號：1672-9692(2015)02-0055-04

2015-01-11

杜夏夏（1993-），女，在讀本科生，動物醫(yī)學(xué)專業(yè)。

徐鵬（1979-），男，講師，主要從事動物寄生蟲病、人畜共患病教學(xué)科研工作。

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（編號201410160019），遼寧省自然科學(xué)基金（編號2014022053）