唐華

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院VIP體檢中心，重慶400042）

人巨細胞病毒感染的實驗室診斷技術(shù)研究進展

唐華

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院VIP體檢中心，重慶400042）

巨細胞病毒/免疫學(xué)；巨細胞病毒感染/診斷；抗原，病毒/分析；綜述

最近研究結(jié)果顯示，人巨細胞病毒（HCMV）的感染率在人群當(dāng)中非常高，流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示我國為HCMV高發(fā)地區(qū)，尤其是在經(jīng)濟發(fā)展相對滯后地區(qū)尤為嚴(yán)重[1]。通過密切接觸感染者的體液（尤其是尿液、唾液、血液和生殖器分泌物）在人群中傳播[2]，HCMV侵入機體后，將長期或終身存在于人體內(nèi)。對于絕大多數(shù)免疫功能正常的個體來說，常表現(xiàn)為沒有臨床癥狀的潛伏感染。對于孕期婦女和兒童，HCMV感染的臨床癥狀較為嚴(yán)重，產(chǎn)前合并HCMV急性感染易導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)以及畸形發(fā)生率增高[3]。在嬰兒出生后3～4周內(nèi)從嬰兒的尿液或唾液中分離出HCMV，是診斷為先天性HCMV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。對于免疫功能低下者，如器官移植后、骨髓移植后、免疫缺陷患者和采用免疫抑制劑治療的患者，HCMV的感染是引起其高致死率的重要原因之一。對于造血干細胞移植者，巨細胞病毒感染是術(shù)后3個月內(nèi)最主要的并發(fā)癥及死亡原因[5]。另有研究表明，HCMV感染與人類動脈粥樣硬化以及冠狀動脈心臟病的發(fā)生也有重要關(guān)系[6-7]。目前針對HCMV感染的實驗室檢查主要集中于器官移植受者、孕婦、新生兒等人群。因此，如何準(zhǔn)確、快速和特異性地監(jiān)測HCMV活動性感染，以指導(dǎo)臨床治療成為了學(xué)者研究的關(guān)鍵。

1 HCMV的生物學(xué)特點

HCMV是人類皰疹病毒5型（HHV-5），屬于皰疹病毒科β亞科，為球形。核衣殼是由162個殼微粒組成的立體對稱20面體，雙鏈線性DNA組成了核衣殼內(nèi)部的病毒基因組核心，而HCMV的核衣殼包含了超過25種病毒編碼的蛋白質(zhì)[8]。HCMV自我復(fù)制的周期分為以下3個階段：即早期、早期和晚期，與之相對應(yīng)的基因分別為α、β和γ，其表達的產(chǎn)物分別稱為即刻早期抗原（IEA）、早期抗原（EA）和晚期抗原。

2 HCMV的檢測方法

2.1 病毒培養(yǎng)診斷HCMV感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”是體液中分離出巨細胞病毒。研究顯示內(nèi)皮細胞、上皮細胞和人胚肺成纖維細胞是HCMV感染的主要對象[9-10]。而分離的傳統(tǒng)方法則是將樣本中的病毒接種到例如人胚肺成纖維細胞的敏感細胞中。HCMV感染人胚肺成纖維細胞后一般需要1～3周的時間才會出現(xiàn)典型的細胞病變，陽性結(jié)果需要進行免疫學(xué)方面的鑒定。而判斷為HCMV病毒分離陰性的診斷結(jié)果至少需要4周以上的時間，必要時還要進行宣傳。由于HCMV增殖速度緩慢，傳統(tǒng)的病毒分離方法已達不到早期快速檢測HCMV的目的。而改良后的細胞快速培養(yǎng)技術(shù)利用了HCMV即刻早期蛋白IE72的單克隆抗體進行免疫熒光實驗或酶聯(lián)免疫實驗，來檢測細胞中病毒表達的即刻早期蛋白。Alexander等[11]建立了一種新的微量病毒檢測技術(shù)，即將免疫熒光技術(shù)與快速組織培養(yǎng)相結(jié)合，先在96孔板中培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞，然后向孔中加入處理過的單克隆抗體，接種后3 d就可以檢測結(jié)果。該方法節(jié)約了確診時間，方便、易行，適合大批量臨床標(biāo)本的檢測。

2.2 病毒抗原的檢測人體感染HCMV后，即可在外周血白細胞中檢測到HCMV抗原。以往使用熒光標(biāo)記抗體通過免疫組化技術(shù)來檢測抗原的方法不但耗費時間長而且操作復(fù)雜。近年來開展的HCMV抗原血癥實驗，即檢測外周血單個核細胞中的HCMV抗原，用于診斷早期活動性HCMV感染。該實驗診斷急性HCMV感染的敏感性和特異性均大于90%，而對于有癥狀的HCMV感染其敏感性為100%。目前主要檢測的是HCMV膜蛋白pUL83（pp65）。它是HCMV感染早期就出現(xiàn)的敏感性標(biāo)記抗原，其肽序列具有高度的保守性，數(shù)量占病毒總蛋白數(shù)量的15%。pp65在HCMV活動性感染后2～24 h內(nèi)就可在血液白細胞當(dāng)中表達，比病毒核酸出現(xiàn)在血漿中的時間更早，并且在病毒活動期間持續(xù)表達[12-13]?；颊呓邮苤委熀笤摰鞍纂S病毒消失而消失，且蛋白表達量與病毒載體量呈正相關(guān)。目前可以用免疫組織化學(xué)和流式細胞術(shù)對pp65作定性和定量的分析。阮光萍等[14]采用流式的方法對pp65進行了檢測，整個操作過程只需要2 h，并且能夠定量檢測pp65抗原陽性細胞。當(dāng)免疫抑制劑和抗病毒藥物等因素影響了白細胞的數(shù)量和功能時，則會影響pp65抗原的檢測，所以HCMV pp65抗原血癥檢測可能不適用于血液移植患者。

2.3 血清學(xué)檢測

2.3.1 HCMV特異性抗體的檢測通過檢測血清中的抗HCMV-IgG和IgM來間接檢測HCMV的感染情況。如果IgG陽性則說明過去感染過HCMV，而血清轉(zhuǎn)化或連續(xù)監(jiān)測IgG滴度連續(xù)升高表明有HCMV活動性感染。在HCMV感染后的1～3個月內(nèi)血清IgM會維持在一個比較高的水平，所以IgM陽性標(biāo)志著病毒處于活動期。但是HCMV潛伏感染率高，因免疫抑制而使HCMV被激活引起復(fù)發(fā)感染時，IgM不一定出現(xiàn)；且移植后免疫功能被免疫抑制劑等藥物所抑制，抗體經(jīng)常延遲產(chǎn)生或短缺，故有HCMV活動性感染時，HCMV IgM檢測不一定呈陽性。在臨床上常將IgM的檢測結(jié)果作為判斷HCMV近期感染或者活動性感染的依據(jù)，將IgG抗體作為HCMV既往感染的指標(biāo)[15]。如果抗HCMV IgM抗體陽性的同時伴抗HCMV IgG抗體陰性，則表明是HCMV原發(fā)性感染。目前用于檢測HCMV抗體的方法有放射免疫法、熒光免疫法和ELISA。運用傳統(tǒng)的ELISA方法檢測HCMV抗體，結(jié)果容易被類風(fēng)濕因子、自身抗體或EB病毒等產(chǎn)生的交叉反應(yīng)所干擾，造成假陽性結(jié)果[16]。目前抗體捕獲ELISA應(yīng)用較多，該方法具有較高的靈敏度和特異性，避免了以上干擾因素，有利于結(jié)果的分析、判斷[17]。吳福清[18]比較了ELISA和RT-PCR對產(chǎn)前篩查女性巨細胞病毒IgM抗體水平檢測的敏感性及特異性，發(fā)現(xiàn)后者的敏感性和特異性更高。

2.3.2 抗體親和力檢測對于免疫抑制者，相對于繼發(fā)感染，原發(fā)感染往往伴有明顯的臨床癥狀；對于孕婦，孕期中發(fā)生的原發(fā)感染對胎兒的影響比繼發(fā)感染更嚴(yán)重。但是檢測特異性抗體只能區(qū)分有無HCMV感染，而不能區(qū)分原發(fā)感染、再感染和潛伏-激活感染。研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染者體內(nèi)IgG抗體親和力水平在接觸抗原后逐漸升高，因此，IgG抗體親和力水平可以區(qū)別是由于近期病毒感染產(chǎn)生還是既往感染遺留。通過聯(lián)合檢測HCMV特異性IgM抗體和IgG抗體的親和力，即以檢測血清IgM抗體作為初篩，然后對IgM抗體陽性的標(biāo)本進行IgG抗體親和力指數(shù)的測定，可明確是否發(fā)生原發(fā)感染[19]。

2.4 HCMV核酸的檢測在體液中，HCMV感染后病毒核酸比血清學(xué)證據(jù)和臨床癥狀出現(xiàn)得更早，因此可將檢測HCMV核酸作為HCMV感染的早期診斷指標(biāo)。HCMV核酸檢測的對象主要為DNA和基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA。HCMV核酸的檢測用于HCMV感染的診斷有其獨特的優(yōu)點：既能夠檢測到未與細胞結(jié)合的病毒又可以檢測不同的標(biāo)本，如外周血白細胞、血漿、組織、支氣管灌洗液和尿液等；即使延遲處理的標(biāo)本對檢測結(jié)果的特異性和敏感性也無明顯的影響。

2.4.1 DNA的檢測PCR在HCMV感染的實驗室診斷中發(fā)揮了重要的作用，該技術(shù)包括巢式PCR、RT-PCR、捕獲探針ELISA-PCR和實時熒光定量PCR（FQ-PCR）等[20]。FQ-PCR技術(shù)的問世填補了普通PCR在HCMV潛伏再激活中的研究，大量研究資料證明HCMV DNA的量變與疾病的進展明顯相關(guān)[21]。FQ-PCR是在PCR的基礎(chǔ)上進一步發(fā)展起來的高靈敏度核酸定量檢測技術(shù)。在PCR循環(huán)中測量的信號作為熒光閾值（threshold）的坐標(biāo)，并引入了Ct值（cycle threshold）這個概念。Ct值是指熒光信號被檢測到時所需的最小循環(huán)數(shù)，即在PCR循環(huán)中熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段這個拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。FQ-PCR的方法有多種，包括SYBR Green、分子信標(biāo)、FRET探針、Lightcycle技術(shù)和Complex探針技術(shù)等。大量研究表明，在HCMV病毒感染后1 h就可檢出HCMV的IE基因[22]。朱雪嬌等[23]使用FQ-PCR檢測了50例臨床乳汁標(biāo)本的HCMV IE基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個體系特異性為100%，重復(fù)性較好，Ct值變異系數(shù)小于5%，整個實驗用時也較短，僅需90 min就可一次性完成大批量檢測，與臨床常用的ELISA方法相比，耗時大大縮短了，操作簡單、方便。

2.4.2 mRNA的檢測應(yīng)用PCR檢測HCMV DNA時，擴增后產(chǎn)生的大量產(chǎn)物非常容易造成實驗室的環(huán)境污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。雖然PCR結(jié)果陰性對HCMV感染的排除率高[24]，但PCR結(jié)果陽性只能證明存在病毒，不能判斷病毒是處于活動感染還是潛伏狀態(tài)，因此要明確診斷需進一步檢測RNA。HCMV mRNA的存在是病毒復(fù)制與否的標(biāo)志，通過檢測HCMV mRNA可以早期診斷出HCMV活動性感染。將RNA模版的反轉(zhuǎn)錄與cDNA的PCR相結(jié)合用于檢測mRNA可以早期診斷HCMV活動性感染，評價體內(nèi)病毒復(fù)制的狀況。另一種檢測HCMV mRNA的方法是核酸基礎(chǔ)序列擴增技術(shù)（NASBA），它是利用硅石依賴的核酸提取術(shù)，在恒溫條件下直接擴增RNA而不需預(yù)先對DNA進行切割和擴增。NASBA整個擴增反應(yīng)僅由3種酶控制，反應(yīng)不需要特殊儀器，易實現(xiàn)自動化；而且反應(yīng)不需要高溫變性步驟，不會受到外來雙鏈DNA的污染；可避免常規(guī)檢測和分析RNA的標(biāo)準(zhǔn)方法中需要大量RNA；反應(yīng)快、敏感性高、重復(fù)性良好[25]。

2.5 生物芯片技術(shù)生物芯片是基于微加工技術(shù)和微電子技術(shù)的微型生化反應(yīng)平臺，不僅用于病毒的抗原和抗體以及核酸的定性和定量檢測，還可用于對病毒變異和多種病毒的同步分析。生物芯片可分為4種類型，包括基因芯片（gene chip）、蛋白質(zhì)芯片（protein chip）、芯片實驗室（lab chip）和“大芯片”技術(shù)。

2.5.1 基因芯片即在玻片或硅片等支持物上有序而高密度的固定排列了大量靶基因片段或寡聚核苷酸片段（分子探針），將熒光標(biāo)記樣本核酸分子后與固定在支持物上的DNA陣列（DNA micro-array）中的探針進行雜交。通過激光共聚焦顯微鏡激發(fā)和檢測雜交后的熒光信號強度，計算和分析樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而可以對基因序列和功能進行大規(guī)模，高通量的研究。近年來的研究顯示，該技術(shù)在病原體檢測方面具有較高的特異性和敏感性[26-27]。

2.5.2 蛋白質(zhì)芯片在生物芯片中，如果點的樣品是蛋白質(zhì)（抗原、抗體或多肽），檢測的對象也是蛋白質(zhì)時，這種芯片稱為蛋白質(zhì)芯片。

2.5.3 芯片實驗室即在一塊或若干塊芯片上完成對蛋白質(zhì)或核酸的提取、雜交，PCR及電泳等一系列分子生物學(xué)操作。芯片實驗室使對核酸和蛋白質(zhì)的檢測更加方便、快速和靈敏。

2.5.4 “大芯片”技術(shù)以共用探針為基礎(chǔ)，同時檢測多基因/位點的PCR技術(shù)。將被檢測的基因或位點的特異性引物置于微孔板上，其設(shè)計原理類似基因芯片。

生物芯片的主要優(yōu)點是：（1）分析過程實現(xiàn)了高度自動化和集成化，大大提高了分析速度；（2）降低了樣品和試劑的用量；（3）能夠同時處理數(shù)個樣本；（4）防止污染，有效排除了外界因素對結(jié)果的影響。但是目前生物芯片技術(shù)的成本過高，僅限于實驗室對HCMV的研究工作。

3 小結(jié)

HCMV與器官移植受者感染，孕婦的產(chǎn)前診斷和新生兒早期診斷之間有著十分緊密的關(guān)系，所以對HCMV檢測的研究就顯得日益重要起來。多數(shù)情況下HCMV感染都屬于亞臨床感染，沒有典型的臨床癥狀，給診斷帶來了較大的困難。目前對HCMV的檢測多依賴于實驗室檢測。由于HCMV病毒培養(yǎng)的時間太長，已不適用于臨床應(yīng)用。而免疫抑制劑的使用和“窗口期”的問題使血清學(xué)檢測缺乏敏感性，在需要區(qū)分病毒原發(fā)感染和繼發(fā)感染時并不是理想的檢測方法，現(xiàn)多用于患者免疫狀態(tài)的評估和孕婦的篩查?？乖Y和核酸的檢測可反映病毒的活動狀態(tài)，敏感性和特異性都較高，適合早期診斷HCMV活動性感染?，F(xiàn)在針對住院患者多采用抗原血癥或者PCR來檢測HCMV，同時采用抗原血癥檢測來對患者進行隨訪[28-29]。但是HCMV的pp65抗原存在于白細胞中，標(biāo)本必須在8 h內(nèi)進行處理，否則檢測的敏感性會大大降低；并且在病毒拷貝數(shù)低的情況下，可能檢測不出pp65抗原[30]。有研究指出，相比于pp65抗原血癥分析，用實時PCR技術(shù)檢測HCMV感染具有更高的敏感性，但對于活動性感染的檢測又不如抗原血癥分析敏感[31]。目前也有將HCMV DNA的檢測與mRNA及血清IgM檢測相結(jié)合作為對妊娠HCMV感染與垂直傳播的評價手段[32]。生物芯片技術(shù)是一種新興的診斷技術(shù)，還存在如假陽性率偏高和需要先對檢測標(biāo)本進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增等缺點，而且檢測成本太高，目前還不適合于臨床應(yīng)用。隨著研究的深入，更敏感、快速、特異且易標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室檢測技術(shù)將在HCMV感染的診斷和治療中起到更大的作用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.03.024

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1009-5519（2015）03-0383-04

2014-04-18

2014-09-19）

唐華（1979-），女，重慶萬州人，護師，主要從事醫(yī)院體檢方面工作；E-mail：462632936@qq.com。