朱振寶， 楊　梅， 易建華， 王留續(xù)

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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酶解桃仁分離蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽的工藝研究

朱振寶， 楊梅， 易建華， 王留續(xù)

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：以桃仁分離蛋白(PKPI)為原料，采用堿性蛋白酶水解桃仁分離蛋白制備了腎素和ACE雙重抑制肽.以體外ACE抑制率和腎素抑制率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)對酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量濃度和加酶量等酶解工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解工藝.結(jié)果表明，堿性蛋白酶水解桃仁分離蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽的最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度50.6 ℃、酶解pH值8.02、加酶量3.06%，所得到的酶解產(chǎn)物ACE抑制率為69.03%、腎素抑制率為57.61%.

關(guān)鍵詞：桃仁分離蛋白； 腎素； ACE抑制肽； 響應(yīng)面法

0引言

當(dāng)今世界威脅人類健康的重要疾病之一是心腦血管疾病，而高血壓則是最常見的心血管病.從食物源提取的降血壓肽因具有營養(yǎng)及安全性，已被用于開發(fā)與降血壓有關(guān)的功能性食品和保健品.其中，ACE抑制肽因其無毒副作用的降血壓功能而成為活性肽研究的熱點(diǎn)[1].雖然其在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了較好的降血壓效果，但隨之而來的副作用如神經(jīng)性水腫和咳嗽等卻很嚴(yán)重[2]；近年來研究表明，腎素抑制肽的降血壓效果很好.故腎素作為降血壓藥物的新靶點(diǎn)，由其研制的降血壓藥劑受到了很大關(guān)注.雖然腎素抑制肽在降血壓方面有著獨(dú)特的效果，但是其可能亦存在風(fēng)險(xiǎn).

鑒于單獨(dú)的腎素抑制肽和ACE抑制肽都存在一定問題，許多研究者嘗試將不同功能的抑制劑聯(lián)合使用，以期降低其副作用從而達(dá)到更好的降血壓效果.研究發(fā)現(xiàn)，ACE抑制劑和腎素抑制劑的聯(lián)合使用在降低血壓的同時，還可以減少對其它器官的損傷[3].何榮[4]已從菜籽蛋白中分離出了腎素和ACE雙重抑制肽.

桃仁為桃加工的副產(chǎn)品，除少數(shù)用作中藥外，大部分被當(dāng)成廢棄物拋棄，造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染.國內(nèi)外研究主要集中在對桃仁的化學(xué)、生物化學(xué)、血液動力學(xué)[5]、藥理[6]、免疫[7]等方面的研究.已有研究[8-10]表明，桃仁中蛋白質(zhì)含量較高，具有重要的生理活性.

本文以桃仁分離蛋白為研究對象，用不同的蛋白酶酶解桃仁蛋白，對其效果進(jìn)行了比較，確定了最適的蛋白酶源.通過單因素實(shí)驗(yàn)，對酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量濃度和加酶量等酶解工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，并根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，這為桃仁蛋白資源的深度開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考.

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

桃仁分離蛋白(PKPI)，實(shí)驗(yàn)室自制(質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.2%)；ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)，來源于兔肺;HHL(馬尿酰-組胺酰-亮氨酸)、馬尿酸，購自Sigma公司；腎素活性測定試劑盒，購自TSZ公司；乙腈、三氟乙酸，色譜純；其它試劑均為實(shí)驗(yàn)室常見分析純級.

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器

501A型超級恒溫器，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；Waters 600型高效液相色譜儀，美國Waters公司；ALPHA1-2/LD-2型冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ公司；JBZ-14H型磁力攪拌器，上海大普儀器有限公司；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，Varioskan Flash，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PKPI的制備工藝流程[10]

桃仁→鹽酸浸泡手工脫皮→烘干→過40目篩粉碎→石油醚脫脂→烘干→堿溶酸沉法提取蛋白→冷凍干燥→PKPI.

1.3.2桃仁蛋白的酶解[11,12]

稱取一定質(zhì)量的PKPI，加無CO2水配制成一定質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)溶液，迅速加熱至85 ℃滅活酶20 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH后，加入適量蛋白酶，混勻，在超級恒溫器中反應(yīng)，在反應(yīng)過程中不斷加入0.5 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液維持體系pH，酶解一定時間后，將酶解液煮沸2 min滅活酶，冷卻，室溫后，調(diào)pH值至中性，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得桃仁蛋白酶解物多肽粉，測定多肽ACE抑制率和腎素抑制率.

1.3.3蛋白酶的篩選[12,13]

分別用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胃+胰蛋白酶等，在酶制劑廠家提供的最適條件下酶解桃仁分離蛋白.通過測定ACE抑制率和腎素抑制率來分析確定適合酶解桃仁分離蛋白的酶.

1.3.4酶解物的抗消化酶解實(shí)驗(yàn)

選取ACE抑制率和腎素抑制率均較高的蛋白酶酶解產(chǎn)物，分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶+胰蛋白酶等進(jìn)行模擬體內(nèi)抗消化實(shí)驗(yàn)，消化后再進(jìn)行ACE抑制率和腎素抑制率的測定.

1.3.5酶解工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

以酶解液的ACE抑制率和腎素抑制率為指標(biāo)，分別研究酶解溫度、酶解pH值、底物質(zhì)量濃度和加酶量等工藝參數(shù)對酶解效果的影響.

1.3.6酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇對ACE抑制率有影響的3個因素,即酶解溫度、酶解pH值、加酶量等，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以ACE抑制率和腎素抑制率為響應(yīng)變量.

1.3.7ACE抑制活性的測定[11-13]

ACE抑制活性的測定采用RP-HPLC直接進(jìn)樣法進(jìn)行.取桃仁分離蛋白的酶解多肽粉溶于硼酸鹽緩沖溶液(pH8.3，0.1 mol/L，其中含0.3 mol/L的NaCl)，配成2.5 mg/mL的樣品溶液.取50μL、5 mmol/L的HHL(溶于相同的硼酸鹽緩沖溶液中) 加入20μL的樣品溶液，混合均勻后于37 ℃預(yù)熱10 min，然后加入10μL、0.1 UN/mL的ACE(溶于上述相同的硼酸鹽緩沖溶液中)，在37 ℃反應(yīng)30 min后，用100μL、1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后過0.45μm濾膜，取20μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣，通過RP-HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，再以馬尿酸的生成量來計(jì)算樣品對ACE的抑制活性，同時做樣品空白(以硼砂-硼酸緩沖液代替樣品溶液).其計(jì)算公式如下：

(1)

式(1)中：c為樣品空白反應(yīng)的色譜峰面積；b為ACE不參與反應(yīng)的色譜峰面積；a為ACE和樣品溶液都參與反應(yīng)的色譜峰面積.

色譜條件如下：色譜柱，DiamonsilTMC18柱(4.6 mm×250 mm)；紫外檢測器，波長228 nm；流動相A,25%乙腈；流動相B,75%超純水(含0.1%TFA)；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，20μL；柱溫，30 ℃；檢測時間，20 min.

1.3.8腎素抑制活性的測定[14]

桃仁蛋白水解肽的腎素抑制活性的測定根據(jù)腎素活性試劑盒提供的方法進(jìn)行.在96孔板中依次加入20μL底物、150μL測試用緩沖液(50 mmol/L Tris-HCL緩沖液，含0.3 mol/L的NaCl，pH7.5)、10μL樣品(濃度為1 mg/mL)，對照組和空白組以純水代替樣品溶液，然后在對照組和樣品組依次加入10μL腎素以啟動反應(yīng)(空白組加10μL測試用緩沖液).

將該微量培養(yǎng)板搖動10 s并在37 ℃下保溫15 min，然后在10 min內(nèi)用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長340 nm和發(fā)射波長490 nm下檢測樣品的熒光強(qiáng)度(FI).其計(jì)算公式如下：

(2)

2結(jié)果與討論

2.1　蛋白酶的篩選

選取底物質(zhì)量濃度為2%、加酶量為5%，在各種蛋白酶的最適酶解pH和溫度條件下反應(yīng)3 h，其不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和腎素抑制率測定結(jié)果如表1所示.

由表1可知，上述蛋白酶在其最適宜條件下對桃仁分離蛋白進(jìn)行水解后，其ACE抑制率和腎素抑制率各有差異.其中,堿性蛋白酶作用于桃仁分離蛋白其酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和腎素抑制率均最高.故選用堿性蛋白酶作為酶解桃仁分離蛋白的最適水解酶.并選用堿性蛋白酶解物做模擬體內(nèi)抗消化實(shí)驗(yàn).

表1　不同蛋白酶酶解的最適條件及結(jié)果

2.2　堿性酶解物的抗消化酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

酶解物的模擬體內(nèi)抗消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物經(jīng)消化后，其ACE抑制活性和腎素抑制活性均有所降低，但整體仍保持了較高的活性.相比單獨(dú)使用胃蛋白酶或者胰蛋白酶的消化，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶連續(xù)消化后其抑制活性有所升高，其原因可能是經(jīng)胃蛋白酶消化后，部分活性肽被降解，再用胰蛋白酶處理后又釋放出了有活性的肽.

表2　模擬體內(nèi)抗消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3　單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1酶解溫度對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

在底物質(zhì)量濃度為2%、酶解pH8.0、加酶量為5%時，酶解3 h，調(diào)節(jié)酶解溫度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃)，桃仁分離蛋白酶解物的ACE抑制率和腎素抑制率的變化如圖1所示.

從圖1可以看出，桃仁分離蛋白的ACE抑制率和腎素抑制率隨著酶解溫度的升高均呈現(xiàn)先迅速上升然后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度達(dá)50 ℃時，ACE抑制率和腎素抑制率均達(dá)到最高.該研究結(jié)果與李建杰等[15]的研究基本保持一致.所以初步選定響應(yīng)面試驗(yàn)酶解溫度的較優(yōu)水平為45 ℃、50 ℃、55 ℃等.

圖1　溫度對ACE 抑制率和腎素抑制率的影響

2.3.2酶解pH對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

在酶解溫度為55 ℃、底物質(zhì)量濃度為2%、加酶量為5%、酶解時間為3 h的條件下，以體外ACE抑制率和腎素抑制率為指標(biāo)，調(diào)節(jié)不同酶解pH值對酶解效果的影響如圖2所示.

從圖2可以看出，桃仁蛋白的ACE抑制率和腎素抑制率隨著pH的變化均呈現(xiàn)先迅速上升然后下降的趨勢.酶解產(chǎn)物的ACE抑制率從50%上升至65%左右，后有所下降，在pH8.0的條件下達(dá)到最高；而腎素抑制率在pH8.5的條件下最高.通過用SPSS軟件分析，綜合考慮酶解物對ACE抑制率和腎素抑制率的影響，選擇響應(yīng)面試驗(yàn)酶解pH的較優(yōu)水平為7.5、8.0、8.5等.

圖2　pH對ACE 抑制率和腎素抑制率的影響

2.3.3酶解底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

在酶解溫度為55 ℃、酶解pH值8.0、加酶量為5%時，酶解3 h，其底物質(zhì)量濃度對桃仁分離蛋白酶解物的ACE抑制率和腎素抑制率的影響如圖3所示.

由圖3可知，在1%~5%的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ACE抑制率和腎素抑制率均先升高后下降.這是由于隨著底物質(zhì)量濃度的增大，大多數(shù)底物被酶解成無活性多肽，較少被酶解為有活性的小肽片段.因此繼續(xù)增加底物質(zhì)量濃度，已經(jīng)對酶解過程影響較小.在底物質(zhì)量濃度為2%時，ACE抑制率和腎素抑制率均達(dá)到最高，故選取底物質(zhì)量濃度為2%.

圖3　底物質(zhì)量濃度對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

2.3.4加酶量對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

在底物質(zhì)量濃度為2%、酶解溫度為55 ℃、酶解pH8.0時，酶解3 h，其加酶量對桃仁分離蛋白酶解物的ACE抑制率和腎素抑制率的影響如圖4所示.

圖4　加酶量對ACE抑制率和腎素抑制率的影響

由圖4可知，在加酶量為3%時，ACE抑制率和腎素抑制率均達(dá)到最高，之后隨著加酶量的逐漸加大，ACE抑制率和腎素抑制率均顯著下降.其原因可能是隨著加酶量的增加，部分有活性的肽被降解為無活性的片段或者游離氨基酸[16].在4%~6%的加酶量范圍內(nèi)，ACE抑制率和腎素抑制率變化趨于平緩，因此選擇響應(yīng)面試驗(yàn)加酶量的較優(yōu)水平為2%、3%、4%等.

2.4　響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取3個主要的因素,即溫度(X1)、pH值(X2)、加酶量(X3)，選擇底物質(zhì)量濃度為2%，酶解時間3 h，進(jìn)行堿性蛋白酶酶解桃仁分離蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析.其因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表3所示.

以ACE抑制率和腎素抑制率為響應(yīng)值，各因素及其交互作用為自變量，采用Design Expert 8.0.6軟件對表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到了回歸方程.

(1)ACE抑制率的擬合方程

ACE抑制率(%)=69.47-0.03X1+3.08X2+2.29X3-2.21X1X2+2.48X1X3-3.76X2X3-5.53X12-8.14X22-3.54X32

(2)腎素抑制率的擬合方程

腎素抑制率(%)=56.28+1.67X1-2.25X2+1.37X3+5.09X1X2+1.17X1X3+4.07X2X3-2.83X12-6.26X22-6.40X32

上式中：X1為溫度編碼值；X2為pH編碼值；X3為加酶量編碼值.

對回歸方程做顯著性檢驗(yàn)與方差分析，其方差分析結(jié)果如表4所示.ACE抑制率中模型方程決定系數(shù)R12=0.942 4，腎素抑制率中模型方程決定系數(shù)R22=0.956 7，說明得到的模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型能夠較好地描述試驗(yàn)結(jié)果.

通過對回歸系數(shù)(F值)的檢驗(yàn)可知，各因素對桃仁蛋白酶解物ACE抑制率的影響順序?yàn)椋篨2(pH)>X3(加酶量)>X1(溫度);對腎素抑制率的影響大小順序?yàn)椋篨2(pH)>X1(溫度)>X3(加酶量).另外失擬項(xiàng)的P值分別為0.680 9、0.595 2均大于0.05，這表明兩模型的失擬項(xiàng)均不顯著，說明這兩個模型建立的回歸方程能夠預(yù)測堿性蛋白酶酶解桃仁分離蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽的條件.

通過Design Expert 8.0.6軟件分析，對回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，得到堿性蛋白酶酶解PKPI的最適酶解條件為：溫度50.6 ℃、pH值8.02、加酶量3.06%.在此條件下，理論預(yù)測PKPI的堿性蛋白酶酶解物ACE抑制率為69.60%、腎素抑制率為56.29%.在此優(yōu)化條件下，做驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到酶解產(chǎn)物ACE抑制率為69.03%，腎素抑制率為57.61%，與軟件得到的理論預(yù)測值接近.所以，在此優(yōu)化條件下，可用堿性蛋白酶酶解PKPI得到桃仁分離蛋白堿性蛋白酶酶解物.

表4　回歸模型方差及顯著性分析

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別采用多種蛋白酶酶解桃仁蛋白，通過比較桃仁蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率和腎素抑制率，確定了堿性蛋白酶為最適水解酶.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為2%時，采用響應(yīng)面分析法，以ACE抑制率和腎素抑制率為指標(biāo)，優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解桃仁蛋白制備腎素和ACE雙重抑制肽的工藝條件.最優(yōu)酶解工藝為：溫度50.6 ℃、pH 8.02、加酶量3.06%.在此優(yōu)化條件下,ACE抑制率為69.03%、腎素抑制率為57.61%.

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Study on enzymatic hydrolysis conditions for the preparation

of dual rennin and ACE inhibitory peptide from

peach kernel protein isolate

ZHU Zhen-bao， YANG Mei， YI Jian-hua， WANG Liu-xu

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The preparation of dual rennin and angiotensin-I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from peach kernel protein isolate with Alcalase 2.4 L was investigated.ACE inhibitory rate in vitro and renin inhibitory rate in vitro were investigated with respect to hydrolysis parameters including temperature,pH,substrate concentration and enzyme dosage.As a result, the optimum conditions for enzymatic preparation of dual rennin and ACE inhibitory peptides from peach kernel protein isolate were found to be hydrolysis at pH 8.02,temperature of 50.6 ℃ and enzyme dosage of 3.06%.Under these conditions,the prepared peptides showed an ACE inhibitory rate of 69.03%,renin inhibitory rate of 57.61%.

Key words:peach kernel protein isolate; rennin; ACE inhibitory peptide; response surface methodology

作者簡介:朱振寶(1971-)，男，陜西商洛人，副教授，博士,研究方向：功能性油脂與植物蛋白

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2014K01-10-04)

*收稿日期:2015-09-23

中圖分類號：TQ936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*文章編號：1000-5811(2015)06-0116-05