宋淑英，劉耀川（遼寧省重大動物疫病應(yīng)急中心，遼寧 沈陽 110161）

豬瘟疫苗簡介及新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展

宋淑英，劉耀川
（遼寧省重大動物疫病應(yīng)急中心，遼寧 沈陽 110161）

豬瘟作為OIE的A類傳染病及我國的一類傳染病，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大。目前，疫苗免疫是對其最有效的預(yù)防手段之一。但隨著病毒變異、流行毒株改變等原因，傳統(tǒng)弱毒活疫苗已逐漸不能夠滿足需求。本文對新型豬瘟疫苗的研究進(jìn)展，及新型豬瘟疫苗佐劑進(jìn)行介紹，為新型疫苗研發(fā)提供參考。

新型豬瘟疫苗；核酸疫苗；佐劑；合成肽疫苗

豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）為一種濾過性病毒，具有較高的接觸傳染性。其引起的豬瘟由于具有較高的致死性已被列為我國一類動物傳染病。自1903年以來，研究人員采用各種免疫方式對豬瘟進(jìn)行預(yù)防和控制[1]。時至今日，免疫接種仍是該病最有效的防控手段之一。本文對豬瘟疫苗及新型疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為豬瘟疫苗研究提供幫助。

1 豬瘟疫苗發(fā)展介紹

自1908年匈牙利研究人員制備成功豬瘟高免血清后，臨床上一直使用高免血清與血毒同時肌肉注射對豬群進(jìn)行免疫。但高免血清工藝復(fù)雜，而且價格昂貴，同時血毒也存在散毒的風(fēng)險。因此各國學(xué)者在其后的半個世紀(jì)中，研制出多種滅活疫苗。在20世紀(jì)后期，隨著病毒培養(yǎng)技術(shù)及疫苗佐劑研發(fā)技術(shù)的革新，多種安全、有效的豬瘟弱毒疫苗也廣泛應(yīng)用于臨床[2]。目前OIE推薦使用活毒疫苗和標(biāo)記疫苗對豬瘟進(jìn)行預(yù)防免疫。

1.1 常用豬瘟活毒疫苗活毒疫苗是由經(jīng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)或經(jīng)非敏感動物傳代培養(yǎng)而致弱的毒株制成的。目前我國市場常用的豬瘟疫苗有5種，豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）、豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）、豬瘟-豬丹毒-豬肺疫三聯(lián)苗、豬瘟成兔脾淋組織苗及豬瘟乳兔脾淋組織苗。其中細(xì)胞苗－豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）和成兔脾淋苗－豬瘟活疫苗（I）的免疫效果最好[3]。但以近兩年使用量最多的豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）的免疫效果為更好。

豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）疫苗是將弱毒株接種于犢牛睪丸細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)物冷凍干燥而成。豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞源）將弱毒株接種于豬睪丸傳代細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)物冷凍干燥而成。而豬瘟脾淋組織苗系是由豬瘟兔化弱毒株接種于健康成年家兔，將感染定型熱的家兔脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行冷凍干燥制成[4]。該類疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，可產(chǎn)生持久的免疫力。

1.2豬瘟標(biāo)記疫苗豬瘟標(biāo)記疫苗是將豬瘟病毒的結(jié)構(gòu)蛋白作為免疫原而制成的。豬瘟病毒能夠合成一個含3 898個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白能夠被進(jìn)一步加工成病毒自身的4個結(jié)構(gòu)蛋白（Erns、C、E1及E2）以及8個非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B），其中病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2為病毒的主要保護(hù)性抗原蛋白，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前已有2種該類疫苗在歐盟使用。該類疫苗不含有豬瘟病毒，不會產(chǎn)生疫苗毒問題[5-6]。

2 新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展

2.1 亞單位疫苗豬瘟亞單位疫苗是將編碼豬瘟病毒的主要抗原（Erns和E2）的基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞或細(xì)菌中，使抗原蛋白高度表達(dá)，并用表達(dá)后的抗原蛋白制成的疫苗。目前已在多種受體中成功表達(dá)出豬瘟的抗原蛋白。如在昆蟲Sf21細(xì)胞、巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)等。由于亞單位疫苗的有效成分為病毒粒子的某一部分[7]，因此具有較好的安全性。但其免疫原性較低，通常需要與佐劑同時使用才能夠達(dá)到理想的保護(hù)效果。

2.2 合成肽疫苗通過生物信息學(xué)技術(shù)，預(yù)測出豬瘟病毒蛋白中與抗原性相關(guān)的氨基酸序列，通過人工合成的方式制備相應(yīng)的氨基酸寡肽，制成豬瘟合成肽疫苗。研究表明，豬瘟病毒693～777位氨基酸為抗原性相關(guān)結(jié)構(gòu)，根據(jù)該處序列制備的合成肽疫苗能夠?qū)?qiáng)毒株產(chǎn)生有效保護(hù)。但在研究中也發(fā)現(xiàn)，僅使用單一的中和抗原表位制備合成肽疫苗，其保護(hù)效果并不十分理想。這與豬瘟病毒自身組成以及易感動物體內(nèi)免疫應(yīng)答因素有關(guān)[8]。因此，豬瘟合成肽疫苗研究的主要方向，是在寡肽制備過程中，增加中和抗原表位的數(shù)量。同時增加具有輔助作用的細(xì)胞抗原表位的數(shù)量。這樣就可以利用有限的抗原表位數(shù)量誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生足夠的保護(hù)效果[6]。

2.3 基因缺失型疫苗將豬瘟病毒中與毒力相關(guān)的基因通過基因工程技術(shù)進(jìn)行敲除，使其失去病毒致病力，但仍保留原有的免疫原性，制成基因缺失型豬瘟弱毒疫苗。在敲除試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒中E2基因?yàn)椴《旧娴谋匾?，將其敲除后病毒無法存活[9]，因此不能通過對E2基因敲除來構(gòu)建豬瘟基因缺失疫苗。而對結(jié)構(gòu)蛋白基因Erns和非結(jié)構(gòu)蛋白基因Npro的敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除這兩個基因后病毒仍能夠生存，且表現(xiàn)為弱毒性，能夠產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。但Ens敲除株的試驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除株雖然能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但抗體產(chǎn)生量較低，保護(hù)效果較差[3]。

2.4 活載體重組疫苗豬瘟病毒活載體重組疫苗是將具有良好免疫原性的病毒目的基因（通常為E2基因），與具有復(fù)制功能的其他載體病毒進(jìn)行整合，該類重組整合疫苗可通過多種途徑進(jìn)行免疫。目前較為成熟的載體為偽狂犬病病毒載體（PRV）、痘病毒載體（VAC）以及腺病毒載體（ADV）。

偽狂犬病病毒載體重組疫苗能夠保持良好的抗原性，同時病毒毒力不返強(qiáng)、對人無傳染性。作為載體的偽狂犬病病毒通常為非必需基因缺失載體。研究發(fā)現(xiàn)，缺失gD和gE非必需基因的載體構(gòu)建的E2蛋白重組疫苗，能夠?qū)慰袢《竞拓i瘟病毒產(chǎn)生雙重保護(hù)效果[10]。

痘病毒為廣宿主病毒，其毒性較弱且基因組較大，因此可插入多個外源大片段基因，且互不干擾表達(dá)。因此采用缺失胸腺激酶基因的痘病毒作為載體，與豬瘟病毒E2基因進(jìn)行整合，能夠得到低毒力的重組痘病毒，免疫后能夠使機(jī)體獲得對豬瘟病毒的免疫能力。目前，使用雞痘病毒為載體的疫苗，其豬瘟病毒保護(hù)率能夠達(dá)到75%[11]。

腺病毒毒力低，易純化，是一種良好的活病毒載體。其E2基因重組疫苗可對豬瘟病毒強(qiáng)毒株產(chǎn)生較好的保護(hù)效果。

活載體疫苗雖具有免疫原性高、保護(hù)效果好等優(yōu)勢，但該類疫苗的安全性和實(shí)用性仍存在爭議。因載體是否會發(fā)生突變，突變后對免疫的影響等因素都未可知。而且一旦重組載體在自然界中與同源或異源菌株發(fā)生基因交換，新的重組變異載體對動物機(jī)體或人類是否安全，這些都需要更深入的研究。

2.5 甲病毒復(fù)制子載體DDNNAA疫苗利用甲病毒（Alphaviruses）中的辛德畢斯病毒（Sindbis viurs）和塞姆里斯森林病毒（Semliki Forest virus）作為復(fù)制子，將豬瘟病毒的E2基因與復(fù)制子融合表達(dá)。研究表明，該類復(fù)制子能夠在宿主細(xì)胞的胞漿中高效表達(dá)，經(jīng)3次肌肉注射免疫的豬，能夠抵抗豬瘟病毒強(qiáng)毒株的攻擊[7,9]。

2.6 DDNNAA核酸疫苗豬瘟核酸疫苗的研發(fā)起步較晚，但其應(yīng)用前景卻十分廣泛?，F(xiàn)階段常用豬瘟病毒E2結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)載體作為疫苗進(jìn)行免疫。最新研究發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒5’端非翻譯區(qū)的NS3蛋白所包含的絲氨酸蛋白酶功能區(qū)中，存在的寡聚核苷酸能夠?qū)ωi瘟病毒的侵襲產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。因此，新型豬瘟核苷酸疫苗可將E2結(jié)構(gòu)蛋白與NS3功能寡聚核苷酸同時整合，該類DNA核酸疫苗具有多表位抗原特性，能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)力。同時能夠有效的排除母源抗體的干擾[7]。

3 豬瘟疫苗佐劑

免疫佐劑又稱非特異性免疫增強(qiáng)劑，其本身不具有抗原性，但可增強(qiáng)抗原的免疫原性或增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，而達(dá)到增強(qiáng)免疫效果的目的[12]。目前也有多種新型豬瘟免疫佐劑的相關(guān)研究。

3.1 豬瘟納米磷酸鈣佐劑磷酸鈣進(jìn)入機(jī)體后能夠活化樹突狀細(xì)胞，使其攝取抗原并轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴結(jié)，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。而納米級顆粒作為異源物質(zhì)可被巨噬細(xì)胞吞噬，可起到免疫增強(qiáng)作用。因此以納米磷酸鈣為主要成分的佐劑，可對豬瘟疫苗免疫起到有效的免疫增強(qiáng)作用。研究表明，以納米磷酸鈣為佐劑的豬瘟多肽疫苗，其免疫后抗體水平雖低于弗氏完全佐劑，但明顯高于單純多肽免疫效果。同時，納米級磷酸鈣對疫苗中的有效多肽成分具有較好的吸附能力，吸附率達(dá)到70%[13]，提高疫苗有效成分利用率。

3.2 豬瘟黃芪多糖佐劑黃芪多糖能夠提高機(jī)體的抗病能力，并具有促進(jìn)生長的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，以黃芪多糖作為佐劑進(jìn)行豬瘟疫苗免疫后，黃芪多糖能有效提高T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞的免疫功能。聯(lián)合免疫后，血清中IgG、IgA、IgM及γ-G-RA免疫球蛋白的水平顯著增高[12]。分析發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠促進(jìn)免疫球蛋白mRNA的表達(dá)與釋放，增強(qiáng)免疫球蛋白水平。同時，黃芪多糖還能夠參與機(jī)體的補(bǔ)體反應(yīng)，放大補(bǔ)體聯(lián)級[8]，促進(jìn)抗原識別部位柔性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂越Y(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)豬瘟抗體形成。

4 小結(jié)

疫苗免疫是防控豬瘟最有效的方法之一，隨著強(qiáng)制免疫工作的開展，傳統(tǒng)豬瘟在我國已不多見。但新型豬瘟及突變強(qiáng)毒株的出現(xiàn)[15-16]，又給豬瘟防控帶來新的挑戰(zhàn)。因此新型豬瘟疫苗的研發(fā)尤為重要。目前利用分子生物學(xué)技術(shù)研制的多種分子層面的豬瘟疫苗，應(yīng)對毒株變異能力強(qiáng)，具有較好的應(yīng)用前景。同時隨著佐劑研發(fā)的不斷深入，都會為豬瘟防控提供強(qiáng)有力的保障。

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Research progress on CSF vaccine and new type CSF vaccine

Song Shuying,Liu Yaochuan
(Emergency center for significant animal epidemic disease,Liaoning Shenyang 110161)

CSF as an A type infectious disease by OIE and type one infectious disease by China, cause a giant harm for breeding industry.By now vaccine immunity is still the best way to prevent CSF.But with the variation of the virus and the changes of prevalent strains,the shortage of tradition live vaccine has been emerged.In this article,the research progress on CSF vaccine and vaccine adjuvant were introduced,providing references for vaccine development.

New type CSF vaccine,Nucleic acid vaccine,Adjuvant,Synthetic peptide

S852.2

A

1672-9692(2015)12-0051-03

2015-10-02

宋淑英（1965-），女，高級獸醫(yī)師，主要從事重大動物疫病防控工作。