王曉果 綜述， 曾東風，孔佩艷 審校

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院血液科,重慶 400037)

·綜 述·

TSP-1與白血病相互關系的研究進展

王曉果 綜述， 曾東風，孔佩艷△審校

(第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院血液科,重慶 400037)

甲基化；白血病；TSP-1

白血病是一組異質性、克隆性的造血干細胞疾病,主要表現為造血干細胞不斷積累的獲得性遺傳學異常,使其發(fā)生克隆性的突變，從而不能進行正常的自我更新、增殖和分化[1]。隨著治療手段的發(fā)展，白血病患者的預后明顯改善，但是復發(fā)及感染并發(fā)癥一直是急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者發(fā)病率和病死率居高不下的主要原因。急性白血病的發(fā)生包括了復雜的基因突變、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多種分子生物學水平的異常。凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)，又稱血小板反應蛋白-1(THBS1)是一種多功能ECM蛋白,在細胞增殖、凋亡、血管生成、炎癥及免疫應答中起重要作用[2]。TSP-1的編碼基因位于人類染色體15q15,全長約16 kb，含有22個外顯子，讀碼框5.8 kb，是候選的抑癌基因。TSP-1基因啟動子區(qū)域高甲基化抑制基因轉錄，與腫瘤及白血病的發(fā)生密切相關。TSP-1基因去甲基化治療、針對TSP-1蛋白相關功能區(qū)域的靶向治療為白血病治療及感染并發(fā)癥的預防提供了新的思路。本文對TSP-1基因啟動子甲基化、TSP-1蛋白與白血病發(fā)生、發(fā)展、感染并發(fā)癥等關系的研究現狀進行綜述。

1 TSP-1蛋白的結構和功能

TSP-1是一種首次在活化血小板中發(fā)現的細胞外基質(extracellula rmatrix，ECM)糖蛋白，是TSP家族研究最多的成分。TSP家族包括TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5。TSP-1在多種細胞中表達，包括脂肪細胞和巨噬細胞，是存在于ECM成分和條件培養(yǎng)基中的一種可溶性分子。TSP-1蛋白是一個大分子的同源三聚體，相對分子質量約145 KU，每個單體由1 152個氨基酸殘基組成富含半胱氨酸的多肽；包括N-端區(qū)域；Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型重復序列；C-末端區(qū)域。不同的細胞表面受體通過連接TSP-1分子特定的區(qū)域發(fā)揮不同的生物學活性。CD36是TSP-1的一個受體，它連接到TSP-1的Ⅰ型重復序列參與信號轉導，發(fā)揮黏附和抗血管生成作用。此外，還可激活天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)，從而誘導內皮細胞和腫瘤細胞的凋亡[3]。TSP-1可參與止血、細胞黏附、遷移，ECM表達，生長因子活性調節(jié)等的創(chuàng)傷修復過程[4]。CD47結合TSP-1的C-端區(qū)域可參與β淀粉樣蛋白炎性反應。并且有研究發(fā)現在T-淋巴細胞和慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)細胞中TSP-1和CD47/凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)相互作用誘導caspase非依賴性細胞死亡信號通路[5]。

2 TSP-1與白血病發(fā)生、發(fā)展的關系

2.1 TSP-1基因啟動子高甲基化與白血病發(fā)病的關系 表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化。DNA甲基化改變是人類腫瘤中最常見的表觀遺傳學改變[6]。在DNA甲基化過程中,甲基化的CpG雙核苷酸通過募集轉錄抑制因子、阻礙轉錄激活因子結合、改變染色質構象等途徑抑制基因的表達。DNA 甲基化的改變被認為是細胞惡性轉化的早期特征,表現為特殊基因的高甲基化伴隨總體低甲基化。低甲基化促進癌基因活化；高甲基化則促使抑癌基因失活導致腫瘤發(fā)生。

血液系統(tǒng)惡性腫瘤的DNA甲基化多表現為廣泛的低甲基化和局部基因啟動子CpG島的高甲基化，這種異常甲基化被認為是血液系統(tǒng)腫瘤的觸發(fā)事件。Li等[7]發(fā)現TSP-1基因在CEM、RAJI細胞中完全甲基化，在Jurkat、K562、MOLT3、HL-60等多種白血病細胞株中發(fā)現TSP-1基因啟動子的部分甲基化。Garcia-Manero等[8]在80例初診的成人ALL患者發(fā)現TSP-1啟動子甲基化頻率11.3%。Greco等[9]對105例骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)，208例初治的AML，72例治療相關的髓系腫瘤(therapy-related myeloid neoplasms，t-MN)基因啟動子區(qū)域甲基化的研究發(fā)現，DAPK、CDH1、TSP-1基因在AML、MDS、t-MN中均發(fā)生甲基化。與初診MDS、AML相比，t-MN患者中DAPK基因啟動子區(qū)域甲基化頻率更高，而TSP-1基因啟動子區(qū)域甲基化頻率在各組之間無顯著差異?；蚪M甲基化與染色體缺失協(xié)同引起抑癌基因的沉默，可能是MDS進展為AML的主要表觀遺傳學改變。

2.2 TSP-1抑制骨髓微血管生成 TSP-1是一種內源性的血管生成抑制因子，腫瘤血管新生在白血病發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Kaur等[10]研究發(fā)現TSP-1通過干擾VEGFR-2與CD47結合，抑制VEGFR-2和AKT的磷酸化，阻斷VEGFR-2的信號轉導，從而抑制腫瘤血管生成。Okumura等[11]提出VEGF與VEGF受體結合激活PI3K/Akt信號通路，PI3K/Akt信號通過影響VEGF表達調節(jié)血管生成，同時PI3K/Akt信號可以抑制TSP-1。TSP-1蛋白還可與CD36分子、caspase-3、p59fyn及p38MAPK等分子結合，減弱內皮細胞生長和遷移，促進內皮細胞凋亡，從而發(fā)揮有力的抗血管生成效應。白血病的特征是白血病原始細胞在骨髓中不斷積累的惡性腫瘤。骨髓血管生成對白血病的發(fā)生和骨髓微血管密度(microvessel density，MVD)增加具有重要作用。骨髓微血管密度在急性白血病(acute leukemia，AL)、慢性白血病(chronic leukemia，CL)、MDS中均有增加[12]。高燕[13]發(fā)現在白血病發(fā)病初期，TSP-1陽性率低，骨髓MVD顯著升高；治療緩解后，TSP-1陽性率升高，骨髓MVD降低。表明TSP-1表達與MVD呈負相關。白血病患者的骨髓和健康對照相比血管密度增加，提示白血病的進展可能會伴隨著血管化增加。B細胞-慢性淋巴細胞白血病(B-cell chronic lymphoblastic leukemic，B-CLL)與健康對照相比血漿中TSP-1水平明顯下降，而骨髓血管增加[14]。Shanafelt等[15]研究發(fā)現TSP-1水平較低的患者疾病進展時間縮短，表明血管生成增加與B-CLL臨床進展相關。

2.3 TSP-1誘導白血病細胞凋亡 TSP-1與其受體CD36結合，激活caspase-3，從而誘導內皮細胞和腫瘤細胞的凋亡。Li等[3]研究發(fā)現TSP-1誘導CD36陽性細胞株CHRF-288-11、Meg-01和HL-60的凋亡，但是不能誘導CD36陰性細胞株K562的凋亡。加入抗CD36抗體FA6-152或血小板生成素(thrombopoietin，TPO)可顯著抑制TSP-1的效應。TSP-1也顯著誘導B細胞-急性淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemic,B-ALL)的細胞凋亡，CD36陰性的細胞不易受TSP-1和FA6-152的影響。從而證實了TSP-1對白血病細胞表現了直接的誘導凋亡效應。Bruel等[16]發(fā)現全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)促進白血病細胞株HL-60和NB4分泌TSP-1，TSP-1可抑制2種細胞的生長，促進分化，誘導凋亡。在NB4細胞中TSP-1誘導凋亡的作用較ATRA強，但是TSP-1誘導的HL-60和NB4細胞的分化和凋亡與Bcl-2或Bax的表達改變不一致，表明和ATRA不同，TSP-1誘導HL-60和NB4細胞的分化不依賴于Bcl-2調節(jié)。同時發(fā)現位于TSP-1的NH2端和Ⅰ型重復序列的2種肝素結合肽(Hep-I和GGWSHW)能促進HL-60和NB4細胞的凋亡，表明細胞表面肝素分子可能參與TSP-1對早幼粒細胞的凋亡效應。ATRA能成功誘導大部分APL患者緩解，但耐ATRA復發(fā)是仍一個重要的問題。Saumet等[17]發(fā)現TSP-1除了在NB4細胞中表達外，在ATRA耐藥的細胞株NB4-LR1中也有表達，同時TSP-1可誘導NB4-LR1細胞的凋亡。TSP-1誘導的NB4-LR1白血病細胞凋亡是以caspase非依賴性機制為特征，TSP-1分子的C-末端結構域由3型重復序列和C-末端球形區(qū)域組成，在白血病細胞中連接CD47和整合素αvβ3誘導caspase非依賴的細胞凋亡。TSP-1與CD47結合也可以誘導B-CLL中caspase非依賴性的細胞凋亡[18]。

2.4 TSP-1與感染并發(fā)癥的關系 感染并發(fā)癥一直是AML患者發(fā)病率和病死率的主要誘因。TSP-1是多功能蛋白，炎癥時分泌到ECM，調節(jié)參與免疫的多種成分。近期多項研究表明感染發(fā)生時TSP-1與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)有一定的相關性。Schnetzke等[19]分析155例接受誘導化學治療的AML患者TLR2和TLR4多態(tài)性，發(fā)現TLR4多態(tài)現象Asp299Gly和Thr399Ile是發(fā)展為敗血癥和肺炎的獨立危險因素。證明了Toll樣受體(TLR4和TLR2)多態(tài)性與AML感染并發(fā)癥的危險性相關。Barcellini等[20]通過對95例B-CLL患者TLR4和TLR9基因表達的分析發(fā)現，B-CLL中TLR4和TLR9表達與感染、自身免疫和疾病惡化相關。TLR4減少的患者疾病惡化和自身免疫疾病進展的危險性增加。TSP-1激活巨噬細胞TLR4通路。Li等[21]研究發(fā)現TSP-1敲除小鼠的巨噬細胞可誘導炎癥表現，提示TSP-1在激活巨噬細胞中發(fā)揮重要作用。后期用重組的人血小板TSP-1處理，能刺激骨髓誘導的巨噬細胞TNF-α表達。同時，TSP-1也可刺激TLR4表達和NF-κB活化。TSP-1介導的TNF-α生成增加在TLR4缺乏的巨噬細胞中消失，表明TSP-1通過TLR4通路激活巨噬細胞。TSP-1也刺激體內巨噬細胞TLR4活性。此外，用抗體阻斷TSP-1和CD36之間的聯(lián)系后，TSP-1調節(jié)的巨噬細胞活性減弱，表明TSP-1刺激的巨噬細胞通路部分上受TSP-1與CD36相互作用的調節(jié)。

3 TSP-1與白血病的診斷及治療

研究表明TSP-1基因啟動子區(qū)域CpG島高甲基化在兒童腎透明細胞肉瘤(CCSK)[22]、類癌等腫瘤具有特異性，可作為此類腫瘤的特異性診斷標志。 Fleitas等[23]發(fā)現TSP-1表達與非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者的預后具有相關性。VEGF和TSP-1可作為進展期NSCLC預后評估的標志。TSP-1在白血病診斷及預后判斷的研究相對較少。Shanafelt等[24]提出CLL細胞可以持續(xù)分泌TSP-1，臨床上VEGF∶TSP-1比例可以預測CLL患者對免疫治療的反應。提示了TSP-1在預測白血病治療反應中有一定的意義。

TSP-1基因啟動子異常甲基化具有可逆性，逆轉啟動子區(qū)域甲基化可以使沉默的基因重新表達。TSP-1基因CpG島在RAJI、Jurkat、K562、MOLT3、HL-60等白血病細胞株存在高甲基化[8],經去甲基化藥物地西他濱(5-aza-zdc)處理后其甲基化水平下降，TSP-1表達上調，細胞表現為生長抑制、分化和凋亡。劉澎等[25]將TSP-1重組腺病毒(ADV-TSP1)轉染入K562細胞裸鼠體內，發(fā)現移植瘤的生長顯著受抑。TSP1f重組腺病毒(ADV-TSP1f)通過抑制腫瘤細胞所處微環(huán)境內血管內皮細胞的增殖，降低血供，減少腫瘤生長刺激因子，從而達到抑癌作用。另外，TSP-1誘導CD36陽性的白血病細胞的凋亡，證實TSP-1對白血病細胞表現了直接的誘導凋亡效應，能夠作為一種常規(guī)治療的輔助方法被研究，尤其是對表達CD36或TSP-1其他受體的白血病細胞[3]。ATRA在調節(jié)細胞生長、分化和死亡方面有重要功能,TSP-1能調節(jié)生長抑制和死亡應答。TSP-1有助于提高APL對ATRA的治療反應。TSP-1在ATRA耐藥的APL治療中具有一定的價值，最適合藥物開發(fā)的TSP-1信號分子靶點的識別有待進一步探索[19]。

4 展 望

抑癌基因啟動子甲基化是細胞癌變過程一個早期、頻發(fā)事件，TSP-1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化與腫瘤及白血病的發(fā)生密切相關。TSP-1是一種多功能糖蛋白，在白血病中主要起抑制骨髓微血管生成、抑制白血病細胞生長，促進分化和凋亡的作用。近期研究發(fā)現TSP-1與TLR4相互作用與AML感染并發(fā)癥有密切關系。深入研究TSP-1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化、TSP-1蛋白在白血病發(fā)生、發(fā)展中的相關機制,對于白血病的早期診斷、治療及預后評估有著積極的意義。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2015.34.043

王曉果(1988-)，在讀碩士，主要從事難治性白血病診療的基礎和臨床研究?！?/p>

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2015-05-11

2015-07-10)