苗延虹*,董光霞

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)院,山東泰安271000

依諾沙星-銪絡(luò)合物為探針的熒光光度法測定肝素

苗延虹*,董光霞

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)院,山東泰安271000

在pH值為7.40的HMT-HCl緩沖溶液中，銪（Eu3+）能和依諾沙星（Enoxacin）形成絡(luò)合物，發(fā)出Eu3+的特征熒光，最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為330 nm和612 nm，狹縫均為5 nm，肝素的加入能使Eu3+的特征熒光顯著增強。在線性范圍0.117～5.85 μg·mL-1內(nèi)，肝素的濃度和熒光強度成很好的線性關(guān)系，線性方程為△F=-5.691+6.98 c（r= 0.994）（c:μg·mL-1）；檢出限為0.06 μg·mL-1。本方法用于實際樣品的測定，靈敏度高、選擇性好、干擾少、操作簡單，結(jié)果令人滿意。

依諾沙星;銪;熒光光譜法;肝素

肝素具有廣泛的生物學(xué)功能,在人體內(nèi)由肥大細(xì)胞分泌而自然存在于血液中，在體內(nèi)外均有延緩或阻止血液凝固的作用，是心血管和血栓病人的首選抗凝血藥，可用于調(diào)血脂、抗血栓，改善血液流變學(xué)指標(biāo)及免疫調(diào)節(jié)等，肝素或其衍生物還可廣泛應(yīng)用于美容、化妝行業(yè)，是一種重要的生化藥物。肝素的檢測以化學(xué)方法為主，文獻報導(dǎo)有分光光度法[1-5]、共振瑞利散射法[6,7]、循環(huán)伏安法[8]、離子色譜法[9]、流動注射法[10]、高效液相色譜法[11]、熒光能量轉(zhuǎn)移法[12]。這些方法中，分光光度法雖然操作簡便、快速、儀器價廉，但線性范圍較窄，高效液相色譜法具有檢出限較低，線性范圍寬的優(yōu)點，但操作繁瑣，儀器設(shè)備昂貴，電化學(xué)方法也不失為一種好的方法，但操作起來仍較復(fù)雜。

本文選擇依諾沙星作為銪離子的配體，研究了以肝素作為共配位體，與依諾沙星共同敏化銪離子特征熒光的可能性。實驗結(jié)果表明，依諾沙星-銪離子體系中銪離子位于612 nm處的特征熒光能夠被肝素顯著增強，且增強的熒光強度與一定范圍內(nèi)肝素的濃度成正比，根據(jù)這一性質(zhì)。本文以ENX-Eu3+作為熒光探針，建立了一種測定肝素的新方法。本方法與上述文獻報導(dǎo)的方法相比，靈敏度較高，選擇性好，干擾少，操作簡單，用于實際樣品的測定，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器pHS-3精密酸度計（上海自動化儀表有限公司），Cary Eclipse熒光分光光度計（美國VARIAN公司）。

1.1.2 試劑肝素鈉針劑：①天津健康藥業(yè)100606；②上海第一生化藥業(yè)100912；依諾沙星(中國藥品生物制品檢定所)貯備液濃度為1.0×10-3mol·L-1,工作液濃度為2.0×10-4mol·L-1，Eu3+貯備液濃度為2.0×10-2mol·L-1,工作液濃度為1.0×10-4mol·L-1；肝素鈉(中國藥品生物制品檢定所)貯備液濃度為1.17 mg·mL-1,工作液濃度為11.7μg·mL-1。HMT-HCl緩沖液（0.1 mol·L-1）：pH值為7.40。以上依諾沙星、肝素鈉儲備液與工作液均需置于0～4℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)保存，所用試劑均為分析純，實驗用水為二次重蒸去離子水。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入1.7 mL 2.0×10-4mol·L-1ENX、1.0 mLpH=7.40的HMT-HCl緩沖溶液（0.1 mol·L-1）、0.5 mL1.0×10-4mol·L-1Eu3+和1.0 mL11.7μg·mL-1Hep，二次重蒸去離子水定容至10.0 mL,振蕩搖勻，10 min后,掃描熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。在λex/λem=330 nm/612 nm處（激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm），用1 cm石英熒光液池,測定熒光強度F，同時測定試劑空白的熒光強度F0,△F=F-F0。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

實驗條件濃度：ENX，3.4×10-5mol·L-1；Eu3+，0.5×10-5mol·L-1；Hep，1.17μg·mL-1；HMT-HCl，pH=7.40（0.1 mol·L-1）

按照實驗方法，分別掃描ENX、Eu3+、ENX-Eu3+和ENX-Eu3+-Hep溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜(見圖1)。由圖1 a可知，ENX-Eu3+-Hep溶液有三個激發(fā)峰，其中301 nm處較強，但為了避免Eu3+的直接激發(fā)以及二級散射影響，選定330 nm為激發(fā)波長，發(fā)射光譜中，曲線1，ENX在416 nm處有一個很強的發(fā)射峰，曲線2，單純的Eu3+水溶液檢測不到Eu3+的特征熒光，比較曲線1和曲線3，可以看出，ENX在416 nm處的發(fā)射強度明顯降低，出現(xiàn)了591 nm和612 nm的Eu3+的特征熒光峰，分別對應(yīng)于Eu3+的3D0-7F1，3D0-7F2能級躍遷。說明ENX和Eu3+生成了二元配合物并發(fā)生分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移，使得Eu3+激發(fā)并發(fā)射特征熒光。曲線4由于肝素鈉的加入生成了Eu3+-ENX-Hep三元配合物,更有利于能量傳遞,使得熒光強度進一步增強。故實驗選取激發(fā)和發(fā)射波長分別為為330 nm和612 nm。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra1.ENX2.Eu3+3.ENX-Eu3+4.ENX-Eu3+-Hep

2.2 影響體系熒光強度的因素

2.2.1 酸度對體系熒光強度的影響在pH值為4.01～8.74范圍內(nèi)考察了溶液的酸度對體系熒光強度的影響（圖2）。實驗結(jié)果表明：pH=7.17～7.60時，體系的熒光強度大而且比較穩(wěn)定，因此選取pH=7.40進行下一步研究。

2.2.2 緩沖液種類及用量的影響實驗了以下緩沖溶液：NH3-NH4Cl、Tris-HCl、NaAc-HAc、HMT-HCl（pH值均調(diào)至7.40）對體系熒光強度的影響。結(jié)果表明：HMT-HCl緩沖體系對熒光增強效果最好。同時實驗了HMT-HCl緩沖液用量的影響，結(jié)果顯示：當(dāng)緩沖液用量在0.8～1.2 mL時熒光較強。故選擇pH=7.40的HMT-HCl緩沖溶液1.0 mL，做進一步的研究。

2.2.3 依諾沙星與銪離子的濃度比對體系熒光強度的影響固定Eu3+濃度為0.5×10-5mol·L-1，對體系在ENX濃度不同時的熒光強度進行測定（圖3）。結(jié)果顯示：ENX與Eu3+濃度比為(6.5～7.5):1時，體系的熒光強度較大。故選擇Eu3+濃度為0.5×10-5mol·L-1(即濃度為1.0×10-4mol·L-1的Eu3+工作液加0.5 mL)，ENX濃度為3.4×10-5mol·L-1(即濃度為2.0×10-4mol·L-1的ENX工作液加1.7 mL)，即ENX與Eu3+濃度比為6.8:1做進一步的研究。

2.2.4 反應(yīng)時間和加入順序的影響在最佳實驗條件下，考察了熒光強度隨時間的變化情況（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各反應(yīng)組分混合后，體系的熒光強度受光照的影響較大,被熒光照射后體系變得不穩(wěn)定。未經(jīng)照射的體系在10 min～60 min內(nèi)熒光值穩(wěn)定。故選擇10 min后開始測定。當(dāng)改變加樣順序時，按ENX、HMT-HCl緩沖液、Eu3+、Hep的順序加入時體系的熒光強度最大，加入穩(wěn)定性也更好，穩(wěn)定時間更長，故實驗中選擇這一加入順序。

圖2 pH值對Eu3+-ENX-Hep體系熒光強度F的影響Fig.2 The influence of pH on F of Eu3+-ENX-Hep system

圖3 依諾沙星和Eu3+的濃度對體系F的影響Fig.3 The influence of ENX and Eu3+concentration on F

圖4 反應(yīng)時間對體系的熒光強度的影響Fig.4 The influence of reaction time on F

2.2.5 干擾物質(zhì)對體系熒光強度的影響在最佳實驗條件下，當(dāng)肝素鈉濃度為1.17μg·mL-1時，研究了一系列常見的干擾物質(zhì)的影響，結(jié)果如表1所示。表中所列干擾物基本不干擾測定。

表1 干擾物質(zhì)對體系熒光強度的影響Table 1 Effect of coexistent substances

2.3 工作曲線、線性范圍及檢出限

在最佳實驗條件下，繪制了肝素鈉濃度c（(g·mL-1）與△F之間的響應(yīng)曲線,線性方程為△F=-5.691 +6.98c(μg·mL-1)，相關(guān)系數(shù)r=0.994，線性范圍0.117～5.85μg·mL-1。取11支10 mL的比色管按實驗方法配制空白溶液，測得s=0.02，檢出限為0.06μg·mL-1。

圖5 Hep工作曲線Fig.5 Working curve of Hep

3 肝素鈉樣品的測定

取兩支肝素鈉針劑（每支標(biāo)示量為12500 IU/2 mL）：①天津健康藥業(yè)批號100606，②上海第一生化藥業(yè)批號100912，用二次重蒸去離子水稀釋至100 mL容量瓶中，再逐級稀釋至測定肝素的線性范圍，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法按實驗方法測定，結(jié)果如表2所示，同時按實驗方法測定效價，結(jié)果如表3所示。由表2和表3可以看出，此方法的回收率令人滿意，故此法可用于針劑中肝素的測定。

表2 肝素鈉樣品測定的回收率實驗(n=5)Table 2 Recovery test of the determination of heparin sodium in samples(n=5)

表3 肝素鈉針劑效價的測定(n=5)Table 3 Determination results of heparin in heparin sodium injection samples(n=5)

4 機理探討

Eu3+的配位數(shù)一般是8，而從實驗數(shù)據(jù)上可以看出Eu3+與ENX濃度比為1:6.8，故Eu3+是不飽和配位，配位化合物中剩余大量正電荷和空軌道。肝素作為一種生物大分子，在水溶液中以帶多個負(fù)電荷的大陰離子形式存在，可與配位化合物以靜電引力相互結(jié)合。同時肝素分子中含有硫酸根離子、羧基等基團，可同時參與配位。肝素的結(jié)構(gòu)是由四糖單元所組成的聚合物，其四糖單元結(jié)構(gòu)如圖6所示,每個四糖單元有3個-OSO3H基、2個-NHSO3H基和2個-COOH基。其中-OSO3H基和-NHSO3H基在上述實驗條件下能夠完全離解。羧基顯弱酸性且肝素中D-葡糖醛酸的pKa值為3.6，所以在上述實驗條件下羧基也能完全離解。實驗所用的肝素含有42個單糖單元,每個肝素四糖單元有7個結(jié)合位點(5個硫酸基和2個羧基)，所以每個肝素分子中總的結(jié)合位點數(shù)為73.5(42×7/4)。因此肝素鈉可以與ENX-Eu3+配合物以靜電作用和配位作用結(jié)合生成具有緊密結(jié)構(gòu)的三元配合物。依諾沙星以及肝素共同作用的結(jié)果使銪離子位于612 nm處的特征熒光增強了數(shù)倍，且增強的熒光強度與肝素的加入量成正比。本文據(jù)此提出了一種以ENX-Eu3+作為熒光探針，測量肝素的新方法。該方法簡便易行，反應(yīng)迅速,穩(wěn)定性好，靈敏度高，用于測定肝素具有較好的線性范圍，用來測定針劑中肝素的含量，結(jié)果令人滿意。

圖6 肝素的四糖單元結(jié)構(gòu)Fig.6 Structure of the tetrasaccharide unit of Hep

[1]徐紅,劉紹璞,羅紅群,等.堿性二苯基萘基甲烷染料褪色分光光度法測定肝素[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2002,23(2):216-218

[2]Niu XL,Zhang WL,Zhao N,et al.Voltammetric determination of heparin based on its interactionwith malachite green[J].Bull.Chem.Soc.Ethiop,2008,22(2):165-172

[3]劉秀英,張超燦,徐衛(wèi)林.甲苯胺藍分光光度法測定肝素鈉的研究[J].化學(xué)試劑,2009,31(4):271-274

[4]郭小群.人體血樣中肝素鈉含量的測定[J].四川理工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,21(2):76-78

[5]司文會,解鵬,訾言勤.夜藍褪色分光光度法測定肝素鈉[J].理化檢驗-化學(xué)分冊,2010,46(11):1334-1336

[6]黃偉濤,梁娣,羅紅群,等.銀(Ⅰ)鄰菲羅啉體系共振瑞利散射測定肝素鈉[J].西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,33(7):50-53

[7]閆曙光,何佑秋,彭娟娟,等.CdTe量子點作探針共振瑞利散射法測定肝素鈉[J].西南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,32(3):67-71

[8]李曉霞,李延清,苗苗,等.聚亞甲基藍碳納米管修飾電極測定肝素鈉[J].河南科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2011,32(2):97-101

[9]Ander B,Karlsson A,Ohrlund A.Determination of heparin on intraocular lens surfaces by ion chromatography[J]. Journal of chromatography A,2001,917(1):105-110

[10]Ghous T.Flow injection determination of heparin by inhibition of ribonuclease(Rnase)[J].Journal-chemical society of pakistan,2004,26(1):28-34

[11]Keire DA,Trehy ML,Reepmeyer JC,et al.Analysis of crude heparin by 1H NMR,capillary electrophoresis,and strong-anion-exchange-HPLC for contamination by over sulfated chondroitin sulfate[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2010,51(4):921-926

[12]劉保生,王晶,薛春麗,等.曙紅-中性紅熒光能量轉(zhuǎn)移抑制法測定肝素[J].分析試驗室,2009,28(9):16-19

Spectrofuorimetric Determination on Heparin Using Enoxacin-Europium Probe

MIAO Yan-hong*,DONG Guang-xia
College of Chemistry and Material Science/Shandong Agriculture University,Taian 271000,China

A new method for determination of Heparin by fluorometry method was established.In HMT-HCl buffer solution at pH 7.40,Eu3+formed complex with enoxacin,which emitted characteristic fluorescence of Eu3+with maximum excitation wavelength at 330 nm,maximum emission wavelength at 612 nm and slit width at 5 nm.Additional Heparin resulted in a remarkable increase in the Eu3+characteristic fluorescence.Within the range of 0.117～5.85 μg·mL-1,the concentration of Heparin had a linear relationship with the fluorescent intensity,with linear equation of△F=-5.691+6.98 c（r=0.994）（c: μg·mL-1）and detection limit of 0.06 μg·mL-1.This method generated high selectivity,high sensitivity and low disturbance, which had been applied to the determination of practical samples with satisfactory result.

Enoxacin;Europium;Spectrofluorimetric;Heparin

0657.31;Q524.6

A

1000-2324(2015)05-0648-04

2013-11-25

2014-01-20

苗延虹(1967-),女,副教授.E-mail:quguoqing@126.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:quguoqing@126.com