趙 樸，蘇紅遼，劉興友，趙 坤，胡建和，王三虎，姚四新，鄭玉姝

(1 河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2 動(dòng)物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3 滑縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 安陽 456400)

NS1基因主要抗原區(qū)的可溶性表達(dá)及其Dot-ELISA檢測方法的建立

趙 樸1,2，蘇紅遼3，劉興友1,2，趙 坤1,2，胡建和1,2，王三虎1,2，姚四新1,2，鄭玉姝1,2

(1 河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2 動(dòng)物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3 滑縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 安陽 456400)

【目的】 可溶性表達(dá)豬流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原區(qū)(NS1′)蛋白，獲得具有良好抗原性的NS1′蛋白，并初步建立檢測NS1抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)方法，為鑒別診斷豬流感病毒感染豬與疫苗免疫豬奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以質(zhì)粒pET28a-NS1為模板，PCR擴(kuò)增NS1基因抗原性較好的區(qū)段NS1′，用EcoRⅠ和XhoⅠ 雙酶切后插入pET-32a(+)，構(gòu)建pET32a-NS1′，經(jīng)PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及DNA測序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，純化NS1′并免疫家兔制備多克隆血清，對其進(jìn)行SDS-PAGE、Western blotting 檢測和免疫熒光分析，并以純化的NS1′作為包被抗原初步建立Dot-ELISA檢測方法。【結(jié)果】 PCR擴(kuò)增獲得了長約250 bp的H3N2 SIVNS1′片段；成功構(gòu)建了重組載體pET32a-NS1′；SDS-PAGE 和 Western blotting 檢測結(jié)果顯示，融合蛋白NS1′大小約34 ku，該蛋白可溶，能與感染SIV的豬血清特異性反應(yīng)，并且用純化蛋白NS1′制備的多克隆血清能識別293T細(xì)胞中表達(dá)的NS1，建立的Dot-ELISA檢測方法可鑒別豬流感病毒感染豬與疫苗免疫豬?！窘Y(jié)論】 實(shí)現(xiàn)了H3N2 SIV NS1′蛋白的可溶性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，以NS1′作為包被抗原，建立了檢測NS1抗體的Dot-ELISA方法。

豬流感病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白1；主要抗原區(qū)域；可溶性表達(dá)；斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)不僅是豬呼吸系統(tǒng)綜合征的重要病原體，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人類健康[1-4]。2009年H1N1 豬流感病毒引發(fā)的流感大流行[5]再次警示人們，控制豬流感即是從源頭上控制人流感。因此，監(jiān)測豬群中流行流感病毒的情況顯得尤為迫切，而建立能夠鑒別豬流感人工免疫與豬流感病毒感染的診斷方法是有效監(jiān)測的前提。

A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1(Nonstructural protein 1，NS1)是A型流感病毒重要的毒力因子[6-8]，僅在流感病毒感染過程中表達(dá)，因此豬流感滅活疫苗免疫豬對NS1的抗體呈陰性，而SIV感染豬的NS1抗體呈陽性。另外，NS1是H3N2 SIV 毒力基因，其缺失后可使病毒毒力大大降低，用缺失NS1基因的H3N2 SIV鼻內(nèi)免疫豬，可針對H3N2 SIV(包括抗原變異株)攻毒產(chǎn)生很好的保護(hù)作用，對異型H1N1病毒攻毒也可產(chǎn)生部分保護(hù)作用[9-10]，并且免疫豬不產(chǎn)生NS1抗體[11]。因此，檢測NS1抗體，能夠區(qū)分流感疫苗免疫豬(包括滅活疫苗和NS1缺失突變?nèi)醵久?和流感病毒自然感染豬。

本課題組先前已經(jīng)表達(dá)了H3N2 SIV 河南分離株NS1基因[12]，但表達(dá)產(chǎn)物存在于包涵體中，變性與復(fù)性耗時(shí)費(fèi)力，并且蛋白大量析出，不便于獲得大量具有活性的NS1蛋白。為獲得可溶性NS1蛋白，本研究分析了NS1的主要抗原區(qū)域(NS1′)，并進(jìn)行克隆、表達(dá)，獲得了NS1′蛋白，SDS-PAGE、Western blotting 和間接免疫熒光表明，表達(dá)的蛋白能夠與SIV 感染豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性，并以純化的NS1′作為包被抗原初步建立了檢測NS1抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌毒株、質(zhì)粒、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物 受體菌Rosetta、293T細(xì)胞、載體pET-32a(+)和pcDNA3.1均由動(dòng)物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心保存；含SIV A/swine/Henan/2/2008(H3N2)NS1基因的pET28a-NS1和pcDNA3.1-NS1載體由河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；普通級健康成年雌性新西蘭兔2只購自河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試 劑TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ和XhoⅠ 內(nèi)切酶及DNA小量膠回收試劑盒，購自Takara 公司；T4 DNA連接酶和Lipofectamine 2000，購自Invitrogen公司；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG，購自Abcam公司；Immobilon ECL發(fā)光液，購自Millipore公司；Thermo Scientific BCA蛋白定量試劑盒，購自賽默飛世爾科技公司；弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑，購自Sigma公司；SIV感染豬血清，采自A/swine/Henan/2/2008(H3N2)分離豬場的感染康復(fù)豬，-80 ℃凍存。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)A/swine/Henan/2/2008(H3N2)NS1基因序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增NS1′的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列為(下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))：上游引物5′-CTCGAATTCATGGATTCCAACACTGTGTCAAG-3′，下游引物5′-ATACTCGAGTCATTAGGAGGCCATGGTC-ATTTTAAGTG-3′。

1.2 NS1′基因的PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系為50 μL:10×TaqDNA聚合酶緩沖液5 μL，100倍稀釋的pET28a-NS1質(zhì)粒1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，20 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足50 μL；反應(yīng)條件是95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。以質(zhì)粒pET28a-NS1為模板，在PTC-100基因擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像儀檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.3 pET32a-NS1′的構(gòu)建及鑒定

將NS1′基因PCR產(chǎn)物純化，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后切膠回收，與經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切并膠回收的表達(dá)載體pET-32a(+)連接，連接體系為：NS1′基因3 μL,pET-32a(+) 1 μL，5×T4 DNA連接酶緩沖液2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足10 μL，16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入受體菌Rosetta，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板上,37 ℃培養(yǎng)14～16 h，挑取單個(gè)菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，并提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-NS1′。將陽性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。NCBI BLAST分析測序結(jié)果。

1.4 pET32a-NS1′的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pET-32a(+)和pET32a-NS1′的Rosetta，接種于含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基上，37 ℃振搖培養(yǎng)至A600為 0.5～0.6，然后按1∶100的體積比加入含有Amp (100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 h(A600為0.5～0.6)，加入0.1 mol/L IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，37 ℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)5 h，吸取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物備用。

1.5 重組蛋白NS1′的SDS-PAGE和Western blotting檢測

1.5.1 SDS-PAGE檢測 將1.4中的誘導(dǎo)培養(yǎng)物，于4 ℃下 5 000 r/min離心10 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體，PBS洗滌3次，用1/10菌液體積的PBS重懸菌體，冰浴超聲5次(10 s/次)裂解菌體，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min ，分別收集上清和沉淀，12%SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白的可溶性，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色，檢測表達(dá)蛋白。同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的pET32a-NS1′及誘導(dǎo)的pET-32a(+)為對照。

1.5.2 Western blotting檢測 利用Western blotting技術(shù)檢測表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性。利用伯樂半干式電轉(zhuǎn)儀于15 V下電轉(zhuǎn)30 min，將SDS-PAGE凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)，50 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，PBST洗滌5次，將SIV感染豬血清(1∶100稀釋)37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次，加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗豬IgG，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次。暗室內(nèi)，將保鮮膜緊密鋪于暗盒，蛋白面朝上放入洗滌好的NC膜，均勻涂上ECL發(fā)光液，折回保鮮膜覆蓋NC膜，再將X膠片放于NC膜上，蓋緊暗盒，曝光10～15 min，取出X膠片，經(jīng)顯影-水洗-定影，晾干，保存結(jié)果。同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)的pET32a-NS1′及誘導(dǎo)的pET-32a(+)為對照。

1.6 NS1′免疫血清的制備

鎳柱親和純化NS1′，按Thermo Scientific BCA蛋白定量試劑盒操作說明，采用BCA法測定純化的NS1′蛋白質(zhì)量濃度為0.26 μg/mL，超濾管濃縮至1.53 μg/mL。將600 μL純化蛋白溶液(含600 μg蛋白)與等體積弗氏完全佐劑混合，乳化，多點(diǎn)背部皮內(nèi)、皮下免疫健康成年新西蘭兔2只，400 μL/只，21 d后，用弗氏不完全佐劑制備疫苗(方法同弗氏完全佐劑)，400 μL/只加強(qiáng)免疫，21 d后耳緣靜脈采血，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)1∶32時(shí)(如達(dá)不到，再次加強(qiáng)免疫)，心臟采血，分離血清，分裝，-20 ℃凍存。

1.7 NS1′免疫血清的有效性

用96孔板培養(yǎng)293T細(xì)胞備用。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000操作說明進(jìn)行：Lipofectamine 2000 0.5 μL和200 ng pcDNA3.1-NS1分別稀釋于25 μL無血清DMEM中，孵育5 min，兩者混合并輕輕混勻，室溫放置20 min，加入轉(zhuǎn)染融合度達(dá)80%的293T細(xì)胞，4～6 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后利用1.6制備的兔血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔為二抗，進(jìn)行免疫熒光檢測。以pcDNA3.1為對照。

1.8 Dot-ELISA方法的建立

以純化的NS1′作為包被抗原建立檢測NS1抗體的Dot-ELISA，方法如下：剪取適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜，以0.26 μg/mL為起始質(zhì)量濃度進(jìn)行2倍比稀釋純化NS1′，每點(diǎn)加樣1 μL，37 ℃溫箱干燥，50 g/L脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，PBST洗滌5次后，將1∶100稀釋的H3N2 SIV感染豬血清(對照為H3N2滅活疫苗免疫豬血清)37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次，用1∶3 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG 37 ℃作用30 min，PBST洗滌5次，置于AEC顯色液中，至出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)后，蒸餾水漂洗終止顯色，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS1′基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增獲得了長度約為250 bp的NS1′基因片段(圖1)，與預(yù)期片段長度一致。

2.2 pET32a-NS1′的鑒定

pET32a-NS1′ PCR擴(kuò)增獲得了約250 bp的片段(圖2-A)， pET32a-NS1′的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定獲得了約5 300和250 bp的DNA片段(圖2-B)，與預(yù)期片段大小一致，表明NS1′基因已成功插入pET-32a(+)載體。NCBI BLAST分析結(jié)果表明，擴(kuò)增基因與國內(nèi)外多株SIVNS1基因?qū)?yīng)序列的同源性≥99.5%。

2.3 重組蛋白NS1′的SDS-PAGE檢測

SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖3-A)顯示，pET32a-NS1′經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約34 ku的重組蛋白，而未誘導(dǎo)pET32a-NS1′轉(zhuǎn)化菌和誘導(dǎo)的pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌則未見相應(yīng)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，并且目的蛋白條帶主要存在于超聲裂解菌離心后的上清中，表明NS1主要抗原區(qū)為可溶性表達(dá)。

2.4 重組蛋白NS1′反應(yīng)原性的檢測

Western blotting結(jié)果(圖3-B)表明，pET32a-NS1′誘導(dǎo)菌在約34 ku處有特異性條帶，而未誘導(dǎo)pET32a-NS1′轉(zhuǎn)化菌和誘導(dǎo)的pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌則未見相應(yīng)條帶，表明誘導(dǎo)菌中表達(dá)的NS1′蛋白能夠與SIV感染陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.5 重組蛋白NS1′免疫原性的檢測

免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，pcDNA3.1-NS1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞具有特異性綠色熒光(圖4-A)，而pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞則沒有綠色熒光(圖4-B)，這說明用重組蛋白NS1′制備的兔血清能與pcDNA3.1-NS1表達(dá)的NS1發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫原性。

2.6 Dot-ELISA方法的建立

由Dot-ELISA顯色結(jié)果(圖5-A)可推算， 純化NS1′能與H3N2 SIV感染豬血清反應(yīng)，且呈現(xiàn)可見斑點(diǎn)的最小量是32.5 ng/μL， 而在對照(圖5-B)中，以等量的純化NS1′與H3N2滅活疫苗免疫豬血清反應(yīng)，沒有可見斑點(diǎn)，表明能將重組NS1′蛋白作為Dot-ELISA的包被抗原，來鑒別診斷SIV感染豬和滅活疫苗免疫豬。

3 討 論

NS1是A型流感病毒的重要多功能毒力因子[7]，并且在A型流感病毒中較為保守[13]。由于豬流感滅活疫苗和NS1缺失致弱SIV 免疫豬不能產(chǎn)生針對NS1的抗體，而流感病毒感染豬可產(chǎn)生NS1抗體，因此，NS1抗體是鑒別豬流感病毒感染豬與疫苗免疫豬的理想靶標(biāo)。為制備NS1抗原，多個(gè)研究小組都表達(dá)了SIV NS1[11,14-15]，但表達(dá)的重組蛋白NS1都存在于包涵體中，需要經(jīng)過變性、復(fù)性、透析等復(fù)雜過程，才能獲得有活性的NS1蛋白，不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且目的蛋白大量析出。

為了獲得可溶性重組NS1，本研究從NS1蛋白、表達(dá)載體及表達(dá)菌株三方面進(jìn)行改進(jìn)，在利用DNAstar分析SIV A/swine/Henan/2/2008(H3N2) NS1主要抗原區(qū)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增NS1主要抗原區(qū)(NS1′)的引物，PCR擴(kuò)增NS1′；為增加NS1′的可溶性，NS1′酶切后插入pET-32a(+)，構(gòu)建pET32a-NS1′；由于Rosetta菌株可補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA、AGG、 AGA、CUA、CCC、GGA及CGG)對應(yīng)的 tRNA，因此有助于提高外源基因表達(dá)水平，并能促進(jìn)目的蛋白的可溶性表達(dá)，因此，選用Rosetta菌株作為表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果表明，本研究成功表達(dá)了可溶性的H3N2 SIV NS1′，該蛋白具有良好的抗原性，并可用作包被抗原建立檢測NS1抗體的Dot-ELISA，為鑒別診斷豬流感病毒感染豬和疫苗免疫豬奠定了基礎(chǔ)，為有效監(jiān)測豬群中流行的流感病毒提供了有效工具。另外，在NCBI BLAST分析中發(fā)現(xiàn)，本研究得到的H3N2亞型SIV河南株NS1的主要抗原區(qū)NS1′，與國內(nèi)外多個(gè)SIV毒株NS1基因?qū)?yīng)序列的同源性≥99.5%，有的可達(dá)100%，這說明將NS1′用作診斷抗原具有較好的代表性和實(shí)用性。

[1] 趙 樸，鄭玉姝，李海燕. 豬流感： 一個(gè)不容忽視的人獸共患病 [J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44(9)：54-56.

Zhao P,Zheng Y S，Li H Y.Swine influenza：Zoonoses which should not be ignored [J].Chinese Journal of Veterinary Medicine，2008，44(9)：54-56.(in Chinese)

[2] Vincent A L,Ma W,Lager K M,et al.Swine influenza viruses a North American perspective [J].Adv Virus Res,2008,72:127-154.

[3] Myers K P,Olsen C W,Gray G C.Cases of swine influenza in humans:A review of the literature [J].Clin Infect Dis,2007,44(8):1084-1088.

[4] Ma W,Lager K M,Vincent A L,et al.The role of swine in the generation of novel influenza viruses [J].Zoonoses Public Health,2009,56(6/7):326-337.

[5] Smith G J,Vijaykrishna D,Bahl J,et al.Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic [J].Nature,2009,459(7250):1122-1125.

[6] 趙 樸，鄭玉姝，賈貝貝，等.NS1A在A型流感病毒感染中的作用 [J].生命的化學(xué)，2008，28(2):140-142.

Zhao P,Zheng Y S，Jia B B,et al.Roles of NS1A in the viral infection [J].Chemistry of Life,2008，28(2):140-142.(in Chinese)

[7] Hale B G,Randall R E,Ortín J,et al.The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses [J].J Gen Virol,2008,89(Pt 10):2359-2376.

[8] Engel D A.The influenza virus NS1 protein as a therapeutic ta-rget [J].Antiviral Res,2013,99(3):409-416.

[9] Vincent A L,Ma W,Lager K M,et al.Efficacy of intranasal administration of a truncated NS1 modified live influenza virus vaccine in swine [J].Vaccine,2007,25(47):7999-8009.

[10] Kappes M A,Sandbulte M R, Platt R,et al.Vaccination with NS1-truncated H3N2 swine influenza virus primes T cells and confers cross-protection against an H1N1 heterosubtypic challenge in pigs [J].Vaccine,2012,30(2):280-288.

[11] Richt J A,Lekcharoensuk P,Lager K M,et al.Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine [J].J Virol,2006,80(22):11009-11018.

[12] 趙 樸，趙 坤，賈貝貝，等.H3N2 SIV 河南分離株NS1基因的克隆及原核表達(dá) [J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24(6):665-667.

Zhao P,Zhao K,Jia B B,et al.Cloning and prokaryotic expression of nonstructural protein 1 gene of a H3N2 SIV isolate from Henan province，China [J].Chinese Journal of Biologicals，2011，24(6):665-667.(in Chinese)

[13] Ozaki H,Sugiura T,Sugita S,et al.Detection of antibodies to the nonstructural protein (NS1) of influenza A virus allows distinction between vaccinated and infected horses [J].Vet Microbiol,2001,82(2):111-119.

[14] 王方昆,袁秀芳,王一成,等.H9N2亞型豬流感病毒NS1基因的克隆表達(dá)及反應(yīng)原性分析 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(2):587-592.

Wang F K,Yuan X F,Wang Y C,et al.Cloning,prokaryotic expression and antigenicity analyzing of NS1 gene of H9N2 swine influenza virus [J].Scientia Agricultura Sinica,2008,41(2):587-592.(in Chinese)

[15] 張 博,郭萬柱,徐志文,等.H3N2亞型豬流感病毒NS1基因的克隆表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(3):297-302.

Zhang B,Guo W Z,Xu Z W,et al.Cloning and expression of swine influenza virus subtype H3N2 and establishment of an indirect ELISA [J].Chinese Journal of Veterinary Science,2011,31(3):297-302.(in Chinese)

Soluble expression of main antigen region ofNS1 gene from H3N2 SIV in Henan and development of Dot-ELISA detection method

ZHAO Pu1,2,SU Hong-liao3,LIU Xing-you1,2,ZHAO Kun1,2,HU Jian-he1,2,WANG San-hu1,2,YAO Si-xin1,2,ZHENG Yu-shu1,2

(1DepartmentofAnimalScienceandTechnology，HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang，Henan453003,China；2ResearchCenterforAnimalDiseasesControlandResiduesSupervision,Xinxiang，Henan453003,China; 3HuaxianAnimalHygienicSupervisionInstitute,Anyang，Henan456400，China)

【Objective】 This study aimed to express the soluble main antigen region(NS1′) ofNS1 gene,acquire NS1′ with good antigenicity,and develop Dot-ELISA method for detecting NS1 antibody so as to differentiate infected from vaccinated pigs.【Method】 Using pET28a-NS1 as template,NS1′ of H3N2 SIV in Henan was amplified by PCR,digested withEcoRⅠ andXhoⅠand cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+).The recombinant pET32a-NS1′ was identified by PCR,EcoRⅠ/XhoⅠdigestion and DNA sequencing.Expression of NS1′ was induced by IPTG in Rosetta and purified,and immune serum was prepared by vaccinating rabbits.The recombinant NS1′ was then analyzed by SDS-PAGE,Western blotting and immunofluorescence.Using NS1′ as coating antigen,Dot-ELISA detection method was developed.【Result】NS1′ of H3N2 SIV with length of ～250 bp was amplified by PCR and the recombinant pET32a-NS1′ was constructed.SDS-PAGE and Western blotting showed that the expressed protein NS1′ was ～34 ku and soluble and it also reacted specifically with serum from pig infected with SIV.Immune serum prepared with NS1′ recognized NS1 expressed in 293T cells.The established Dot-ELISA method was able to differentiate infected pigs from vaccinated pigs.【Conclusion】 NS1′ was successfully expressed in soluble form,expressed NS1′ has good antigenicity and Dot-ELISA method for detecting NS1 antibody was developed.

swine influenza virus;nonstructural protein 1;major antigen region;soluble expression;Dot-ELISA

2014-11-11

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)項(xiàng)目(122300410135)；河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2011A230008)

趙 樸(1975-)，男，河南南陽人，講師，碩士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：zhpu2008@163.com

鄭玉姝(1977-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)及免疫學(xué)研究。 E-mail:yszheng2003@163.com

時(shí)間:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.004

S852.65+1

A

1671-9387(2015)06-0035-06

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