鄒 磊，冀紅芹，劉禹含，孫 會，秦貴信

(吉林農業(yè)大學 動物科技學院，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，吉林 長春 130118)

日糧鈣水平對仔豬成骨細胞活性和脛骨性能的影響

鄒 磊，冀紅芹，劉禹含，孫 會，秦貴信

(吉林農業(yè)大學 動物科技學院，動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，吉林 長春 130118)

【目的】 研究日糧鈣水平對仔豬血清堿性磷酸酶活性、骨鈣素質量濃度、血清鈣濃度及脛骨鈣含量和密度的影響，為鈣調控仔豬成骨細胞活性提供依據。【方法】 采用單因子完全隨機分組設計，將60頭杜長大仔豬(體質量(21.8±2.1) kg)分成6個處理，每處理設10個重復，每重復1頭豬。各處理分別飼喂鈣水平為0.30%，0.45%，0.60%，0.75%，0.90%和1.05%的玉米-豆粕型日糧。預飼期為7 d，正式試驗期28 d，并在正式試驗的14和28 d屠宰仔豬，測定其血清鈣濃度、血清活性標志物堿性磷酸酶活性和骨鈣素質量濃度及脛骨鈣含量和密度，分析鈣水平對仔豬成骨細胞活性和脛骨性能的影響?！窘Y果】 隨著日糧鈣水平的提高，血清堿性磷酸酶活性呈先減小后增大的趨勢(P<0.05)，且在日糧鈣水平為0.75%時出現(xiàn)最小值；血清骨鈣素質量濃度呈先增大后減小的趨勢(P<0.05)，且在鈣水平為0.75%時達到最大(P<0.05)；日糧鈣水平對血清鈣濃度無顯著影響(P>0.05)，但對脛骨鈣含量、脫脂脛骨干質量、脛骨灰分含量、脛骨密度4項脛骨性能指標影響顯著(P<0.05)，且在日糧鈣水平為0.75%時，各項脛骨性能指標均達到最大?！窘Y論】 日糧鈣水平為0.75%時，仔豬脛骨中成骨細胞的礦化作用最大，增殖活性最小。

仔豬；日糧鈣水平；成骨細胞活性；血清鈣；脛骨性能

鈣是動物生長所必需的礦物質營養(yǎng)元素。在動物體內，鈣能調節(jié)肌肉和神經的興奮性，維持體液的酸堿平衡等，更重要的是其參與著動物骨骼的新陳代謝過程。大量研究表明，鈣水平的不同會影響動物的骨骼性能和血液生化指標[1-2]，因此鈣是配制豬日糧時應考慮的重要因素之一[3]。作為動物骨形成作用及骨重建作用的主要功能性細胞，成骨細胞本身可合成、分泌多種生長因子，并以自分泌的方式調節(jié)自身的代謝、增殖和分化，其中成骨細胞自身分泌的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(Osteocalcin，OCN)是評價成骨細胞活性的重要指標。本試驗研究了在日糧中添加不同劑量鈣對仔豬血清ALP活性、OCN質量濃度和血清鈣濃度及脛骨性能的影響，旨在為鈣調控仔豬成骨細胞的活性研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用單因子隨機分組設計。將60只健康狀況良好的杜長大仔豬按平均體質量(21.8±2.1) kg隨機分為6個處理，每處理10個重復，單圈飼養(yǎng)。6個處理分別飼喂鈣水平為0.30%,0.45%,0.60%,0.75%,0.90%,1.05%的試驗日糧，各日糧的配方組成見表1。試驗時間35 d，前7 d為預飼期，后28 d為正式試驗期。試驗在吉林農業(yè)大學養(yǎng)殖基地進行，試驗期間仔豬自由采食，鴨嘴式飲水器自由飲水，按常規(guī)的免疫程序免疫。喂料量以仔豬吃飽后略有剩余為準，記錄采食量。各組的試驗條件均保持一致。

1.2 試驗日糧

試驗日糧以玉米和豆粕為主要原料，按照美國NRC豬營養(yǎng)需要(1998版)配制。除鈣含量不同外，日糧中其他營養(yǎng)成分均滿足仔豬的營養(yǎng)需要。不同鈣水平試驗日糧的營養(yǎng)指標如表2所示。

注：1) 預混料為每千克日糧提供：VA5 000 IU，VD1 000 IU，VE10 mg，VK32 mg，VB11 mg，VB22 mg，VB120.01 mg，葉酸0.1 mg，CuSO4·5H2O 30.4 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 580 mg，ZnSO4·7H2O 512 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，KI 0.36 mg，Na2SeO31.1 mg; 2)營養(yǎng)水平均為計算值。

Note:1)The premix provides the following per kg diet：VA5 000 IU，VD1 000 IU，VE10 mg，VK32 mg，VB11 mg，VB22 mg，VB120.01 mg，F(xiàn)olic acid 0.1 mg，CuSO4·5H2O 30.4 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 580 mg，ZnSO4·7H2O 512 mg，MnSO4·H2O 11.9 mg，KI 0.36 mg,and Na2SeO31.1 mg; 2) Nutrient levels are calculated values.

1.3 樣品采集

分別于正式試驗期的第14和28天，每組隨機選取3只豬，靜脈采血20 mL于非抗凝采血管中， 4 ℃下3 000 r/min離心15 min制備血清，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。采血后，按照標準屠宰工藝進行屠宰，迅速摘取右側脛骨，剔除脛骨上附著的肌肉及筋膜等組織,稱質量后分裝在提前準備好的自封袋中，于-20 ℃冰柜保存?zhèn)溆?。屠宰結束后，參照陳艷君[4]的脫脂方法，對脛骨樣品進行脫脂，制備成風干樣于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定項目及方法

1.4.1 血清鈣濃度 采用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定血清鈣濃度[5]，使用羅氏P800全自動生化分析儀進行測定。

1.4.2 血清成骨細胞活性標志物 血清中的ALP的活性和骨鈣素質量濃度，分別采用堿性磷酸酶酶聯(lián)免疫試劑盒和骨鈣素酶聯(lián)免疫試劑盒進行檢測。

1.4.3 骨鈣含量 骨鈣含量采用原子吸收分光光度法測定[5]，所用儀器為AA-800型原子吸收分光光度計(美國PE)，測定結果為風干基礎。

1.4.4 脫脂骨干質量 將所有骨樣置于70 ℃烘箱中烘72 h，然后將骨樣從中間折為2截，分別用脫脂紗布包扎，貼簽，并置于無水乙醚中連續(xù)浸泡，無水乙醚每天更換1次，1周后取出，待乙醚揮發(fā)徹底后，將脫脂骨樣在105 ℃烘箱中烘6 h后稱質量，即得脫脂骨干質量[5]。

1.4.5 脛骨灰分含量 脛骨灰分參照張麗英等[6]的方法進行測定，在茂福爐中的灰化時間為36 h。

1.4.6 脛骨密度(BMD) 在長春中日聯(lián)誼醫(yī)院采用雙能X線骨密度儀(法國)進行測定。將自然解凍至室溫(20 ℃左右)的脛骨置于探測器下，選前端和1/2處為測定點，啟動裝置，測定儀自動測定并計算脛骨密度(BMD)。

1.5 試驗數(shù)據處理

試驗數(shù)據利用SPSS 17.0軟件進行方差分析，并進行Duncan氏多重比較，統(tǒng)計顯著性水平為P<0.05。各組試驗數(shù)據均以“平均值±標準差(Means±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 日糧鈣水平對仔豬血清鈣濃度和成骨細胞活性標志物的影響

由表3可以看出，日糧鈣水平對14和28 d屠宰仔豬血清堿性磷酸酶(ALP)活性有顯著影響(P<0.05)，隨日糧鈣水平的提高，14和28 d仔豬血清ALP活性均呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢，且均以日糧鈣水平為0.75%時的血清ALP活性顯著低于0.30%和1.05%鈣水平(P<0.05)，14與28 d屠宰仔豬血清中的ALP活性在鈣水平為0.45%和0.90%時差異不顯著(P>0.05)，其余鈣水平之間均有一定差異(P<0.05)。當日糧鈣水平由0.30%升高到1.05%時，14和28 d屠宰仔豬血清中的骨鈣素(OCN)質量濃度均呈先增高后降低的趨勢，且均以日糧鈣水平為0.75%時的血清OCN質量濃度最高，并顯著高于其他鈣水平(P<0.05)；不同鈣水平之間相比，14 d屠宰仔豬血清OCN質量濃度的差異均達顯著水平(P<0.05)，28 d屠宰仔豬血清的OCN質量濃度除0.45%與0.60%及0.30%與0.90%鈣水平間差異不顯著(P>0.05)外，其余鈣水平間均有顯著差異(P<0.05)；在鈣水平為0.30%時，14與28 d屠宰仔豬血清中的OCN質量濃度差異不顯著(P>0.05)，而在其余鈣水平之間均差異顯著(P<0.05)。日糧鈣水平及飼喂時間對仔豬血清鈣濃度影響均不顯著(P>0.05)。

注：同列數(shù)據后小寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)；同行數(shù)據后大寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，大寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

Note:Same lowercase letters in each column indicate insignificant difference (P>0.05),while different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).Same uppercase letters in each row indicate insignificant difference (P>0.05),while different uppercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below.

綜合來看，隨著日糧鈣水平的增大，仔豬血清中的ALP活性呈先減小后增大趨勢，且在日糧鈣水平為0.75%時最小，血清仔豬OCN質量濃度在日糧鈣水平為0.75%時達到最大。

2.2 日糧鈣水平對仔豬脛骨性能的影響

由表4可以看出，本試驗條件下，日糧鈣水平對試驗仔豬脛骨各項性能指標均有顯著影響(P<0.05)。14和28 d仔豬脛骨鈣含量均隨著日糧鈣水平的上升呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，均在日糧鈣水平為0.75%時出現(xiàn)最高值，且28 d仔豬的脛骨鈣含量均高于14 d (P<0.05)。脫脂脛骨干質量隨著日糧鈣水平的升高呈先升高后降低趨勢，在鈣水平為0.75%達到最高，28 d仔豬脫脂脛骨干質量的變化趨勢與14 d時保持一致，但大于14 d的脫脂脛骨干質量(P>0.05)。仔豬脛骨灰分以0.60%～1.05% 4個鈣水平下的含量顯著較0.30%和0.45%鈣水平時高(P<0.05)，0.75%鈣水平下的仔豬脛骨灰分含量最大(P<0.05)，0.60%，0.90%與1.05%鈣水平之間差異不顯著(P>0.05)。14d時，日糧鈣水平對試驗仔豬脛骨前端處密度影響不顯著(P>0.05)，但試驗仔豬脛骨前端處密度隨日糧鈣水平的升高呈先升高后降低的趨勢，在日糧鈣水平為0.75%時出現(xiàn)最高值；0.75%鈣水平時仔豬脛骨1/2處密度顯著高于0.30%鈣水平(P<0.05)，但各鈣水平之間差異不顯著(P>0.05)。28 d時，日糧鈣水平對仔豬脛骨前端處密度和脛骨1/2處密度影響顯著(P<0.05)，其變化趨勢與14 d時一致。當日糧鈣水平為0.30%時，14和28 d的脛骨鈣含量和脫脂脛骨干質量差異顯著(P<0.05)，其他脛骨性能指標差異不顯著(P>0.05)；當日糧鈣水平為0.45%時，14和28 d的脛骨鈣含量、脫脂脛骨干質量和脛骨1/2處密度差異顯著(P<0.05)，其他脛骨性能指標均差異不顯著(P>0.05)；當日糧鈣水平為0.60%時，14和28 d仔豬的所有脛骨性能指標均差異顯著(P<0.05)；當日糧鈣水平為0.75%時，14和28 d仔豬脛骨灰分含量的差異不顯著(P>0.05)，其他脛骨性能指標均差異顯著(P<0.05)；當日糧鈣水平為0.90%時，14和28 d仔豬的脛骨鈣含量和脛骨灰分含量差異不顯著(P>0.05)，其他脛骨性能指標差異顯著(P<0.05)；日糧鈣水平為1.05%時，14和28 d仔豬脛骨性能指標的表現(xiàn)與日糧鈣水平0.90%時相同。

2.3 不同日糧鈣水平下仔豬血清指標與脛骨性能的回歸分析

在不同日糧鈣水平條件下，以28 d時仔豬的脛骨鈣含量、脛骨灰分含量、脫脂脛骨干質量和脛骨密度為因變量(Y)，以血清中的堿性磷酸酶活性和骨鈣素質量濃度及血清鈣濃度為自變量(x)建立回歸方程，結果如表5所示。

由表5可見，在日糧不同鈣水平條件下，血清ALP活性與5項脛骨性能指標均呈負相關關系(自變量系數(shù)為負)，且擬合程度較好，除血清ALP活性與脛骨1/2處密度的線性方程外，其他各方程的R2均大于或等于0.70；血清OCN質量濃度與5項脛骨性能指標均呈正相關關系(自變量系數(shù)為正)，且擬合程度非常好，其中血清OCN質量濃度與脛骨鈣含量、脛骨灰分含量、脫脂脛骨干質量和脛骨前端密度線性方程的擬合程度均較好，R2均接近或大于0.90；血清鈣濃度與5項脛骨性能指標均呈正相關關系(自變量系數(shù)為正)，且擬合程度較好，其中血清鈣濃度與脫脂脛骨干質量線性方程的擬合程度最好(R2>0.90)。

3 討 論

3.1 日糧鈣水平對仔豬成骨細胞活性標志物的影響

ALP是在堿性環(huán)境中能水解磷酸脂產生磷酸的幾種同工酶的統(tǒng)稱，在動物體內廣泛存在,血清中的ALP有50%來源于骨,其余50%主要來自肝臟和小腸。通過肝臟和小腸進入血中的ALP活性表現(xiàn)穩(wěn)定，因此血清ALP活性的變化主要由是骨代謝引起的，所以血清的ALP活性可以間接反映成骨細胞的活動狀況。又由于ALP主要是由分化的成骨細胞分泌，故常作為成骨細胞增殖分化的早期標志物，且當骨礦化、骨形成發(fā)生障礙時，ALP的分泌量會有所升高[7]。本試驗結果表明，隨著日糧鈣水平的增加，仔豬血清中的ALP活性呈先減小后增大趨勢，這與Eklou-Kalonji等[8]的研究結果一致。在本試驗中，日糧鈣水平為0.75%時仔豬血清中的ALP活性最低，這是由于當日糧鈣水平為0.30%～0.75%時，動物機體攝入的鈣水平表現(xiàn)不足，為了維持血鈣的平衡，破骨細胞活性增強，動員骨鈣入血，并使骨骼鈣化受阻，進而刺激了成骨細胞的增殖分化，使其大量分泌ALP，這一過程符合生物學規(guī)律，而當日糧鈣水平從0.75%提高到1.05%時，ALP活性升高，說明在此范圍內，成骨細胞的增殖活性隨著日糧鈣水平的升高而升高。

成骨細胞成熟后，在其基質礦物化時期會分泌OCN。OCN是一種骨非膠原蛋白,占骨非膠原蛋白的 10%～20%[9]，其生理功能是保持骨的正常礦化,抑制由于異常的羥磷灰石結晶沉積所致的軟骨礦化,促進骨基質成熟[10-11]。除分布在骨基質外，OCN還可以分泌入血[12]，所以OCN是成骨細胞成熟分化的標志[13]，可以反映成骨細胞的成骨性能，是評估骨轉換及骨形成的特異性標志物[14]。本研究表明，隨著日糧鈣水平的升高，OCN質量濃度呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，且在日糧鈣水平為0.75%時血清中的OCN質量濃度最高，而且脛骨鈣含量和脛骨密度最大，說明在此日糧鈣水平下，仔豬脛骨骨髓中的成骨細胞多數(shù)處于成熟期，其礦化作用明顯。

3.2 日糧鈣水平對仔豬脛骨性能的影響

由于機體代謝鈣會優(yōu)先滿足骨鈣沉積的需要，所以脛骨鈣含量反映了骨鈣的沉積量，也可反映成骨細胞骨形成作用的強弱，而脛骨密度更能反映動物的骨質量及骨代謝情況，脛骨灰分含量和脛骨脫脂干質量也是評價脛骨性能的常用指標。在本試驗條件下，日糧鈣水平低于0.75% 時，隨著日糧鈣水平的降低，仔豬各項脛骨性能指標皆隨之降低，這說明缺鈣可直接影響到仔豬骨骼的正常發(fā)育。大量試驗結果表明，缺鈣會嚴重影響動物骨骼的發(fā)育，使動物骨骼的鈣含量、骨礦含量及密度降低，甚至使其空間結構發(fā)生改變[15-17]。本研究表明，當日糧鈣水平高于 0.75% 時，仔豬脛骨鈣含量、脛骨灰分含量、脫脂脛骨干質量和脛骨密度均隨著鈣水平的升高而降低，這與王曉宇等[5]、林映才等[18]的研究結果一致；李文立等[19]和王燦楠等[20]的研究也表明，日糧鈣水平過高或過低均不利于仔豬骨鈣的沉積。

3.3 日糧不同鈣水平下各生化指標與脛骨性能指標的回歸分析

線性回歸方程可以反映日糧不同鈣水平下各項血清指標與脛骨性能指標的關系，進而預測成骨細胞骨形成作用的強弱。本研究結果表明，作為一種可以使骨骼正常礦化和轉換的蛋白質，血清中的OCN質量濃度與脛骨各項性能指標均呈顯著正相關關系，說明在日糧不同鈣水平下，脛骨性能隨著OCN質量濃度的升高而增強。血清中的ALP活性與脛骨各項性能指標均呈負相關關系，表明在不同日糧鈣水平下，隨著ALP活性的升高，脛骨性能降低。有研究表明，血清鈣濃度可以影響骨的形成[21]，新骨的形成需要血清鈣的提高[22]。本試驗結果顯示，日糧不同鈣水平對血清鈣濃度影響不顯著，但血清鈣濃度隨著日糧鈣水平的升高呈先升高后降低的趨勢，并與脛骨各項性能指標(P<0.05)呈顯著的正相關關系。

4 結 論

仔豬血清中的ALP活性與脛骨各項性能指標呈顯著負相關關系,OCN質量濃度和血清鈣濃度與脛骨各項性能指標呈顯著正相關關系,且在日糧鈣水平為0.75%時，仔豬血清中的ALP活性最低，OCN質量濃度最高，脛骨各項性能最佳，說明此時成骨細胞增殖活性最小,礦化作用達到最大。

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Effects of dietary calcium level on osteoblast activity and tibia performance of piglets

ZOU Lei,JI Hong-qin,LIU Yu-han,SUN Hui,QIN Gui-xin

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,KeyLabofAnimalProductionandSafetyofMinistryofEducation,JilinKeyLabofAnimalNutritionandFeedScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 The effects of different calcium levels on calcium content in bones,serum alkaline phosphatase concentration,serum osteocalcin concentration,serum calcium concentration,calcium content in tibia and BMD of tibia of piglets were investigated to provide theoretical basis for using calcium levels in dietary to adjust osteoblast activity of piglets.【Method】 The completely randomized design was adopted and a total of 60 experimental piglets with similar body weights (21.8±2.1) kg were randomly allotted into 6 treatments with 10 repetitions in each treatment and one pig was a repetition.Piglets were fed diets with six different calcium levels (0.30%,0.45%,0.60%,0.75%,0.90% and 1.05%) randomly in a single factorial arrangement.The preparation trial period was 7 d,and the trial period was 28 d.The serum alkaline phosphatase concentration,serum osteocalcin concentration,serum calcium concentration and tibia performance were measured at d14 and d28 to investigate the effects of calcium level on ossification of osteoblasts and tibia performance.【Result】 Alkaline phosphatase concentration in serum decreased at first and increased subsequently with the increase of dietary calcium level,and the lowest value was observed in 0.75% group (P<0.05).Osteocalcin concentration in serum was contrary to alkaline phosphatase,and it reached the peak in 0.75% group (P<0.05).Calcium content in serum of piglets had no significant difference with the increase of dietary calcium (P>0.05),but the effects on calcium content of tibia,dry weight of defatted tibia,ash content in defatted tibia and BMD of tibia were significant (P<0.05) withthe highest values in 0.75% group (P<0.05). 【Conclusion】 When the calcium level was 0.75%,ossification of osteoblasts in tibia was the greatest and the activity was the minimum.

piglets;calcium level of diet;osteoblast activity;serum calcium concentration;tibia performance

2013-12-09

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(200903006)

鄒 磊(1986-)，男，吉林長春人，碩士，主要從事肉豬營養(yǎng)與飼料研究。E-mail:zoulei2011@sina.com

孫 會(1962-)，男，吉林省吉林市人，教授，博士，碩士生導師，主要從事肉豬營養(yǎng)與飼料研究。 E-mail:hui1688@163.com

時間:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.002

S828.4+1

A

1671-9387(2015)06-0021-07

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.002.html