雷紅靈,方響亮，周大寨

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

堇葉碎米薺硒蛋白的體內(nèi)抗氧化作用研究

雷紅靈,方響亮，周大寨

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

【目的】 探討富硒植物堇葉碎米薺硒蛋白的生理活性，為富硒植物的深度開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。【方法】 以從湖北恩施富硒植物堇葉碎米薺葉片中提取的硒蛋白作為硒來(lái)源，設(shè)置硒質(zhì)量濃度分別為2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白液灌胃飼喂小鼠4周，研究不同的硒蛋白溶液對(duì)小鼠體質(zhì)量、血硒水平、血液和肝組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影響?！窘Y(jié)果】 硒蛋白液的硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL時(shí)，小鼠體質(zhì)量增加最多；在本試驗(yàn)條件下，小鼠血硒水平隨硒質(zhì)量濃度的增加而升高；硒質(zhì)量濃度為4.45～17.79 μg/mL的硒蛋白液可明顯提高小鼠血液及肝組織的T-AOC、SOD活性和GSH-Px活力，抑制MDA的生成，但硒質(zhì)量濃度為8.90～17.79 μg/mL時(shí)，促進(jìn)效應(yīng)減緩?！窘Y(jié)論】 堇葉碎米薺硒蛋白可以促進(jìn)小鼠的生長(zhǎng)及抗氧化能力，最適硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL。

堇葉碎米薺；硒蛋白；血硒；抗氧化作用

硒是人和動(dòng)物必需的微量元素，它具有抗氧化、抗腫瘤、解毒重金屬以及增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒感染的免疫力等功能[1-2]，但是硒在有益和致毒之間的劑量差異很小。甘璐等[3]研究表明，補(bǔ)硒量為20 μg/kg 的大鼠，其機(jī)體內(nèi)的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量降低，同時(shí)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH- Px)活性升高，而補(bǔ)硒量為40，80 μg/kg 的大鼠，其體內(nèi)MDA 含量增加，CAT、GSH-Px 和硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase，TR)活性降低，同時(shí)伴隨著TR mRNA 表達(dá)水平降低，表明體內(nèi)的氧化系統(tǒng)被激活，抗氧化系統(tǒng)受抑制，發(fā)生了一定程度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，說(shuō)明硒只能在一定的劑量范圍內(nèi)有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。相比無(wú)機(jī)硒，天然有機(jī)硒的毒性更低、更安全，營(yíng)養(yǎng)更全面，生物利用度高[4-5]，因此抗氧化能力更優(yōu)。羅培林等[6]研究顯示，酵母有機(jī)硒比亞硒酸鈉具有更高的生物學(xué)效價(jià)；李改平等[7]比較了有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒對(duì)小鼠全血GSH-Px 活性、肝SOD活性的影響，結(jié)果顯示，有機(jī)硒能顯著增強(qiáng)小鼠GSH-Px活性，提高SOD 活性，且硒蛋白的生物效應(yīng)比硒多糖的更為明顯；張勁松等[8]研究表明，煙葉硒蛋白制劑能顯著提高大鼠血清GSH-Px活性，降低大鼠血清中MDA含量；煙葉的含硒Rubisco蛋白對(duì)清除自由基、防護(hù)紅細(xì)胞溶血、保護(hù)化學(xué)性肝損傷的效果優(yōu)于不含硒蛋白質(zhì)[9]。

植物通過(guò)根部和葉片吸收的無(wú)機(jī)硒，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成硒氨基酸、硒蛋白、硒多糖等有機(jī)形式，其中硒蛋白是最主要的存在形式。植物硒蛋白是一種高效、優(yōu)良的補(bǔ)硒源，尤其是純化的硒蛋白，可以作為保健品的添加劑和原料藥加以利用。湖北恩施的魚(yú)塘壩，是世界上惟一的獨(dú)立硒礦床所在地，生長(zhǎng)著一種富硒能力極強(qiáng)的植物——堇葉碎米薺，其苗期葉片硒含量超過(guò)1 000 mg/kg，這是在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的超富硒植物。為了了解該植物硒蛋白的生物活性，本試驗(yàn)以昆明小鼠為對(duì)象，研究堇葉碎米薺葉片硒蛋白在小鼠體內(nèi)的抗氧化活性，以期為該植物的深層次開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試硒蛋白從成熟野生堇葉碎米薺葉片(含硒量627.59 mg/kg，可溶性蛋白含量86.35 g/kg)中分離純化而得，硒蛋白的含硒量為177.93 μg/g。

試驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)昆明種小白鼠(25 g/只左右，購(gòu)于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，飼料由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以我國(guó)推薦的人體硒最高攝入量[10]為依據(jù)，按照人與試驗(yàn)小鼠的換算系數(shù)(1∶9.01)及小鼠體質(zhì)量，計(jì)算確定試驗(yàn)小鼠飼喂硒量最高為1.80 μg/(d·只)。采用隨機(jī)分組法將小白鼠分為6組，每組12只，雌雄各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中1組不做任何操作(空白對(duì)照，ck1)，1組灌胃純水(陽(yáng)性對(duì)照，ck2)，另4組分別飼喂硒質(zhì)量濃度為2.25，4.45，8.90，17.79 μg/mL的硒蛋白溶液，每天1次，每次0.2 mL/只。常規(guī)喂養(yǎng)飼料，試驗(yàn)期間每周稱體質(zhì)量1次，連續(xù)4周。

1.2.2 小鼠血清、溶血液和肝組織勻漿的制備 小鼠喂養(yǎng)第4周末，空腹斷頭處死，采血，取臟器。血液分成2份：一份不加防凝劑，靜置10 min，2 000 r/min 低溫離心10 min，取血清，4 ℃保存；另一份加肝素抗凝， 4 ℃冷藏備用，測(cè)試時(shí)用蒸餾水稀釋50倍，制備溶血液。肝臟用預(yù)冷生理鹽水漂洗，吸干水分，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝組織勻漿，4 ℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.2.3 小鼠肝組織勻漿和血液抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的肝組織勻漿和血清 0.10～0.20 mL，參照南京建成生物制品公司試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定以下指標(biāo)。

(1)MDA含量。以四氧甲基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)，在532 nm波長(zhǎng)處比色，計(jì)算肝組織勻漿的MDA含量(nmol/mg)和血清的MDA濃度(nmol/mL)。

(2)總抗氧化能力(T-AOC)。37 ℃時(shí)，以每分鐘每毫升血清或每毫克組織蛋白使反應(yīng)體系的吸光度值增加0.01為1個(gè)總抗氧化能力單位(U)。

(3)GSH-Px活力。肝組織GSH-Px活力以催化GSH的反應(yīng)速度表示，組織中每毫克蛋白質(zhì)、每分鐘除非酶促反應(yīng)外，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位；全血GSH-Px活力單位為，每4 μL全血在37 ℃反應(yīng)5 min后，除非酶促反應(yīng)外，反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位。

(4)SOD活性。以每毫升反應(yīng)液中(或每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中)SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活力單位(U)，即U/mg或U/mL。

1.2.4 硒和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 硒含量的測(cè)定采用氫化物發(fā)生-原子熒光分光光度法(采用北京吉天儀器有限公司AFS-930 氫化物發(fā)生雙道原子熒光光度計(jì)，硒標(biāo)準(zhǔn)液(GSB07-1253-2000)為國(guó)家環(huán)?？偩謽?biāo)準(zhǔn)樣品研究所提供)，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250(進(jìn)口分裝)法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 硒蛋白對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

按不同處理飼喂小鼠4周后，各處理組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常，外觀、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲、大小便及皮毛、膚色等均未見(jiàn)異常。試驗(yàn)期間小鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，灌胃1周后，ck2及硒處理組小鼠的體質(zhì)量均出現(xiàn)了不同程度下降，這可能是因?yàn)楣辔覆僮鲗?duì)小鼠產(chǎn)生了影響。飼喂2周后，各組小鼠體質(zhì)量開(kāi)始增加，4周后灌胃硒蛋白液各組的小鼠體質(zhì)量增加率都高于對(duì)照，增加最多的是8.90 μg/mL 試驗(yàn)組，增加率為30.36%；17.79 μg/mL組的增加率低于另外2個(gè)低硒(2.25和4.45 μg/mL)處理組，說(shuō)明硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL的硒蛋白液對(duì)小鼠生長(zhǎng)的促進(jìn)作用已明顯減弱。

2.2 硒蛋白對(duì)小鼠血液中硒水平的影響

硒蛋白對(duì)小鼠血液中硒水平的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，2個(gè)對(duì)照組小鼠血液中硒質(zhì)量濃度為0.12～0.14 μg/mL，二者沒(méi)有顯著差異；飼喂不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液可以明顯提高小鼠血液中的硒水平，且血液中硒水平隨著飼喂硒質(zhì)量濃度的增加而升高，均顯著高于2個(gè)對(duì)照組，各硒處理組間也都有顯著性差異，小鼠血液中硒質(zhì)量濃度最高達(dá) 0.35 μg/mL。

2.3 硒蛋白對(duì)小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

2.3.1 對(duì)MDA含量的影響 不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液對(duì)小鼠肝組織勻漿和血清中MDA含量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，小鼠肝組織勻漿和血清中MDA的含量在硒蛋白處理組與2個(gè)對(duì)照組間有顯著性差異，硒蛋白處理可以降低MDA含量，并在硒質(zhì)量濃度為8.90 μg/mL時(shí)抑制作用達(dá)到最大；而在硒質(zhì)量濃度17.79 μg/mL時(shí)抑制作用減小，MDA含量又開(kāi)始增加。

2.3.2 對(duì)T-AOC的影響 不同硒質(zhì)量濃度的硒蛋白液對(duì)小鼠肝組織勻漿和血清T-AOC的影響見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，硒蛋白處理組小鼠的肝組織勻漿和血清的T-AOC持續(xù)增加，與2個(gè)對(duì)照組有顯著性差異，但硒質(zhì)量濃度8.90與17.79 μg/mL 2個(gè)處理組間沒(méi)有顯著差異，且隨著硒質(zhì)量濃度的增大，小鼠肝組織勻漿和血清T-AOC的增加趨勢(shì)都在減緩。血清和肝組織勻漿T-AOC(y)與血液中硒質(zhì)量濃度(x)的回歸方程分別為：y=83.60x-8.04,R2=0.98,P=0.006 7<0.01;y=10.37x+1.68,R2=0.98,P=0.000 1<0.01，可見(jiàn)，T-AOC與血液中的硒水平具有極顯著相關(guān)性。

2.3.3 對(duì)GSH-Px活力的影響 由圖4可以看出，硒蛋白處理組小鼠GSH-Px與2個(gè)對(duì)照組小鼠有顯著性差異，且隨著硒質(zhì)量濃度的增加，肝組織勻漿和血液中的GSH-Px活力增強(qiáng)。血液和肝組織勻漿中GSH-Px活力(y)與血液中硒質(zhì)量濃度(x)的回歸方程分別為：y=349.77x+182.88,R2=0.98,P=0.000 1<0.01;y=159.42x+106.22,R2=0.94,P=0.000 1<0.01，可見(jiàn)GSH-Px活力與血液中的硒水平具有極顯著相關(guān)性。

2.3.4 對(duì)SOD活性的影響 由圖5可以看出，與2個(gè)對(duì)照組相比，硒蛋白處理組小鼠的肝組織勻漿和血清中SOD活性均有顯著增加，但在硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL時(shí)，增幅下降。這與MDA含量的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明硒質(zhì)量濃度17.79 μg/mL時(shí)已超過(guò)了小鼠的最適硒攝入量，所以SOD活性增幅下降，而MDA抑制作用減小，含量開(kāi)始增加，但此硒攝入量仍可以提高小鼠的抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

GSH-Px是谷胱甘肽氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)中重要的含硒酶，硒參與組成其活性中心；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，SOD則是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它們?cè)谇宄钚匝踝杂苫?、抵抗氧化損傷、調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原狀態(tài)等方面起著重要作用，因此可以利用生物體內(nèi)這些指標(biāo)的變化評(píng)價(jià)硒的抗氧化性。

關(guān)于硒蛋白的抗氧化作用，唐玫等[11]研究表明，富硒藻藍(lán)蛋白對(duì)有機(jī)體的SOD 和GSH-Px 活性都有顯著提高，特別是對(duì)肝臟GSH-Px 活性有極顯著的提高作用；對(duì)堇葉碎米薺含硒蛋白的體外抗氧化研究結(jié)果顯示，硒蛋白有較好的抗氧化活性[12]。本研究的結(jié)果也顯示，在試驗(yàn)設(shè)置的硒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，小鼠GSH-Px活力和T-AOC隨硒質(zhì)量濃度的增加而增大，且與血液中的硒水平呈極顯著正相關(guān)；SOD活性也不同程度升高，MDA生成則被抑制。這些結(jié)果提示，硒蛋白提高了小鼠血液中的硒水平，促進(jìn)了含硒酶的合成及活性，抑制了過(guò)氧化物的生成，提高了小鼠的抗氧化能力。

本試驗(yàn)中，硒質(zhì)量濃度為17.79 μg/mL的硒處理組，灌胃硒量為3.56 μg/(d·只)，超出了小鼠的最大耐受硒量，該硒劑量對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及抗氧化的促進(jìn)效應(yīng)減小，但仍高于對(duì)照，未表現(xiàn)明顯的毒害，這可能是因?yàn)榈鞍孜晕腚装彼岜晃?，在體內(nèi)由密碼子UGA翻譯編碼進(jìn)蛋白質(zhì)中[13-14]，其毒性效應(yīng)會(huì)降低；此外，小鼠本身具有的防御機(jī)制和適應(yīng)能力也可能消除該劑量硒的毒性影響。有研究表明，超營(yíng)養(yǎng)劑量的硒攝入量可以降低動(dòng)物和人類癌癥的發(fā)病率[15]。本研究中小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果顯示，第1周給藥后，最高硒處理組小鼠體質(zhì)量減少最多，除了灌胃操作影響其生長(zhǎng)外，高質(zhì)量濃度的硒溶液應(yīng)該也是其影響因素，之后的體質(zhì)量增加，可能與小鼠的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)。

綜合來(lái)看，小鼠體質(zhì)量的變化趨勢(shì)與機(jī)體內(nèi)抗氧化活性的變化規(guī)律存在正相關(guān)性。說(shuō)明適量的堇葉碎米薺硒蛋白可以提高小鼠血液中的硒水平，促進(jìn)血液及肝臟的T-AOC、GSH-Px和SOD活力；減少肝臟和血清中MDA的生成，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

志 謝：本研究工作得到了湖北民族學(xué)院的湖北省重點(diǎn)(特色)學(xué)科林學(xué)一級(jí)學(xué)科的支持，在此表示感謝！

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Invivoantioxidation of selenoprotein inCardamineviolifolia

LEI Hong-ling,FANG Xiang-liang,ZHOU Da-zhai

(SchoolofBioscienceandBiotechnology,KeyLaboratoryofBiologicalResourcesProtectionandUtilizationofHubeiProvince,HubeiMinzuUniversity,Enshi,Hubei445000,China)

【Objective】 The physiological functions of selenoprotein in hyperaccumulator were investigated to improve the development and utilization of Se-rich plants.【Method】 Selenoprotein,purified from leaves ofCardamineviolifoliain Enshi,Hubei Province,was feed to Kunming mice by gastro gavage for 4 weeks.The mass concentrations of selenium in selenoprotein solution were 2.25,4.45,8.90 and 17.79 μg/mL,respectively.Physiological parameters including weight,blood selenium levels,the total antioxidant capacity,SOD,GSH-Px,and MDA in blood and liver tissue were detected.【Result】 The weight of Kunming mice increased the most when selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.Blood selenium levels increased with the increase of selenium concentration.When the mass concentrations of selenium were 4.45-17.79 μg/mL,selenoprotein significantly enhanced the total antioxidant capacity,SOD,GHS-Px activity and inhibition on MDA formation,but the increasing rates decreased when selenium mass concentrations were 8.90-17.79 μg/mL.【Conclusion】 Selenoprotein in leaves ofCardamineviolifoliapromoted the growth and antioxidant ability of Kunming mice,and the optimum selenium mass concentration was 8.90 μg/mL.

Cardamineviolifolia;selenoprotein;blood selenium level;antioxidant activity

2013-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360498)；湖北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012FFC02501)；國(guó)家民委科研項(xiàng)目(12HBZ008)；湖北省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(D20131902)；湖北民族學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(MY2011B006)

雷紅靈(1967-)，女，湖北鶴峰人，教授，博士，主要從事硒生理生化研究。E-mail:leihl123366@163.com

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.021

Q493.99

A

1671-9387(2015)01-0201-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.021.html