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腦脊液流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)非霍奇金淋巴瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的價(jià)值*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.1017.025.html

陳夢(mèng)翔， 黃韻紅**， 胡云飛， 申苗苗， 黃德佩

(貴州省腫瘤醫(yī)院 腫瘤科， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 評(píng)價(jià)腦脊液流式細(xì)胞術(shù)(CSF-FCM)在非霍奇金淋巴瘤(NHL)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)受侵的診斷和預(yù)后的價(jià)值。方法： 18例NHL初治患者，腦脊液(CSF)采用CSF-FCM和腦脊液細(xì)胞學(xué)(CSF-C)方法檢測(cè)，比較兩種方法檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)受累的陽(yáng)性率，同時(shí)觀察患者性別、年齡、臨床分期、B癥狀、乳酸脫氫酶(LDH)、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分、體能狀態(tài)PS評(píng)分等相關(guān)臨床因素的關(guān)系。結(jié)果： CSF-FCM檢測(cè)NHL患者CNS受侵的診斷陽(yáng)性率高于CSF-C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)；單因素分析結(jié)果顯示CSF-FCM在檢測(cè)NHLCNS受累時(shí)免疫表型陽(yáng)性與年齡、B癥狀及LDH有關(guān)(P=0.039、0.001及0.009)。結(jié)論： NHL累及CNS時(shí)CSF-FCM免疫表型檢測(cè)優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢查。

[關(guān)鍵詞]非霍奇金淋巴瘤； 中樞神經(jīng)系統(tǒng)； 腦脊液； 流式細(xì)胞學(xué)； 細(xì)胞學(xué)

侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin,s lymphoma，NHL)是一種嚴(yán)重危及患者生命的腫瘤，治療效果不佳，預(yù)后差，病死率高。在臨床上檢測(cè)NHL是否侵犯CNS，對(duì)NHL的治療和預(yù)后顯得尤為重要。目前診斷NHL患者CNS受累的方法主要包括腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查(cerebrospinal fluid cytology，CSF-C)和腦脊液流式細(xì)胞術(shù)(cerebrospinal fluid flow cytometry，CSF-FCM)，其中FCM已被較為廣泛的應(yīng)用到淋巴造血系統(tǒng)疾病的診斷和研究中[1-3]。本研究旨在比較CSF-FCM與傳統(tǒng)CSF-C兩種檢查方法在檢測(cè)NHL患者CNS受累情況中的優(yōu)越性及關(guān)系，為臨床檢測(cè)NHL中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累情況提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1　對(duì)象

收集淋巴瘤科2012年3月~2013年3月NHL患者18例，男性13例，女性5例，年齡7~74歲，中位年齡49歲。入組病例均經(jīng)淋巴結(jié)或結(jié)外組織病理確診為NHL，既往無(wú)鞘內(nèi)注射化療史，參照2012年NCCN指南，同時(shí)至少具備以下條件之一：(1)病理類(lèi)型為淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(lymphoblalstic lymphoma，LBL)、Burkitt淋巴瘤(burkitt lymphoma，BL)等高度侵襲性淋巴瘤；(2)病變累及鼻竇、睪丸、乳腺、硬膜外、大細(xì)胞淋巴瘤侵犯骨髓或本身為艾滋病(human immunodeficiency Virus，HIV)合并NHL；(3)有≥2個(gè)結(jié)外部位受累和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase ，LDH)升高，結(jié)外器官受累≥2個(gè)是重要危險(xiǎn)因素；(4)兒童NHL，主要包括LBL、BL、間變大細(xì)胞淋巴瘤以及彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤；(5)排除其他原因所致的神經(jīng)學(xué)缺陷以及精神狀態(tài)改變。

1.2　方法

記錄患者的性別、年齡、臨床分期、功能狀態(tài)(performance status，PS)評(píng)分、B癥狀、LDH水平、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index，IPI)評(píng)分等臨床資料，應(yīng)用CSF-C和CSF-FCM檢測(cè)患者CSF標(biāo)本的細(xì)胞免疫表型，比較兩種方法檢測(cè)NHL合并樞受累診斷的陽(yáng)性率，分析兩種方法與患者年齡、臨床分期、B癥狀及血清LDH等相關(guān)臨床因素的關(guān)系。

所有入組患者均進(jìn)行腰穿收集CSF，每位患者的CSF分為2份，每份2~3 mL，分別用于CSF-C及CSF-FCM檢查。(1)CSF-C新鮮CSF標(biāo)本，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。采用CSF沉淀室法制片，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，自然干燥。CSF-C染色采用邁-格-姬(May-Grunwald-Giemsa，MGG) 染色法，光鏡下觀察。(2)CSF-FCM制備單細(xì)胞懸液，進(jìn)行表面標(biāo)志染色。取3支試管，每管中分別加入20 μL以下抗體或同型對(duì)照(管1：CD45、CD20、CD22、CD10、CD5、CD19；管2：CD45、CD2、CD3、CD4、CD38、CD8、CD15、CD13、CD117、CD33、CD14；管3：CD45、CD16、CD64、CD11b、CD34、HLA-DR、CD45、Kappa、Lambda、CD19、CD45、FCM7、CD13、CD23；抗體及同型對(duì)照均來(lái)自于美國(guó)Becton-Dickinson公司)。新鮮CSF標(biāo)本低速離心，1 000 r/min 5 min，棄上清。在顯微鏡下行CSF細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度≤1×106/mL，取80 μL離心后CSF標(biāo)本，分別加入3支流式管中，流式管中均需加入熒光試劑(PerCP-CY5.5、FITC、PE、APC、PE-CY7、APC-CY7)?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?5 min，再加入1 mL PBS混勻,低速1 000 r/min 5 min離心，棄上清，洗滌2次。分別再加入200 μL PBS上機(jī)檢測(cè)，使用Becton-Dickinson公司FACSDiva Version 6.1.2軟件進(jìn)行分析。(3)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)CSF-C檢測(cè)是對(duì)CSF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究，CSF中發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞是診斷的唯一可靠依據(jù)。CSF-FCM免疫表型陽(yáng)性需結(jié)合WHO(2008)血液淋巴瘤分類(lèi)4th Edition進(jìn)行分類(lèi)，并參照白血病腦脊液FCM結(jié)果分析。FCM陽(yáng)性：CSF不混血，F(xiàn)CM可檢測(cè)到異常免疫表型；CSF混血或血性CSF，F(xiàn)CM異常免疫表型比例高于外周血幼稚細(xì)胞比例。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用四格表資料的χ2檢驗(yàn)比較兩種方法的優(yōu)越性；CSF-FCM檢測(cè)陽(yáng)性與臨床相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的關(guān)系用Logistic回歸分析；兩種檢查方法一致性用kappa檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。

2結(jié)果

2.1　CNS受累情況

CSF-C與CSF-FCM檢測(cè)NHL患者CNS受累患者的病例數(shù)分別為0例和5例，診斷陽(yáng)性率分別為0和27.8%。CSF-FCM診斷NHL患者CNS受累的陽(yáng)性率高于CSF-C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)。NHL患者年齡<60歲、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B癥狀及LDH升高時(shí)，CSF-FCM優(yōu)于CSF-CC，P值分別為0.042、0.041、0.021、0.029，見(jiàn)表1。

表1　兩種方法與總病例臨床因素檢測(cè)結(jié)果(n)

2.2　NHL患者CSF-FCM結(jié)果

CSF-FCM檢測(cè)陽(yáng)性率與年齡有關(guān)，平均(24±16)歲(t=-2.255，P=0.039)，并與有B癥狀(χ2=10.879，P=0.001)及LDH升高(χ2=6.923，P=0.009)有關(guān)，見(jiàn)表2。本組病例經(jīng)CSF-C細(xì)胞學(xué)檢查未見(jiàn)陽(yáng)性樣本，暫不能推斷FCM及細(xì)胞學(xué)兩種檢查方法在診斷NHL侵犯CNS時(shí)一致性的吻合度。CSF-FCM檢測(cè)陽(yáng)性的5例患者，結(jié)合臨床表現(xiàn)及輔助檢查，明確NHL侵犯CNS的有2例，1例為48歲女性(左乳腺?gòu)浡驜細(xì)胞淋巴瘤)，見(jiàn)圖1-A；1例為7歲男孩(淋巴母細(xì)胞淋巴瘤)，見(jiàn)圖1-B；2例患者于診斷CNS受累后2~3月內(nèi)死亡。

表2　FCM與臨床因素回歸分析

3討論

CNS侵犯是非霍奇金淋巴瘤的嚴(yán)重并發(fā)癥，易導(dǎo)致患者死亡[7-10]。研究統(tǒng)計(jì)淋巴瘤發(fā)生CNS受累患者中數(shù)生存期為2.4~4.4個(gè)月[9-11]。有CNS侵犯的NHL患者，為避免延誤治療或治療過(guò)度，臨床上急切需要尋找NHL侵犯CNS的確切診斷依據(jù)。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查易受主觀因素影響，CSF-C檢查需要一定的細(xì)胞數(shù)量，若細(xì)胞濃度太低，則很難獲得準(zhǔn)確的結(jié)果[12]。本組18份CSF標(biāo)本中，經(jīng)CSF-C檢查未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本，而CSF-FCM檢查發(fā)現(xiàn)5例陽(yáng)性病例，可以認(rèn)為是CSF-C檢查的局限性，造成漏診。但由于樣本較少，還不能對(duì)CSF-FCM及CSF-C兩種檢查方法診斷NHL侵犯CNS進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖1　NHL患者CSF-FCM陽(yáng)性腦脊液檢測(cè)Fig.1　CSF-FCM results of two NHL patients

當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時(shí)，免疫表型參數(shù)對(duì)各種淋巴瘤的診斷和鑒別診斷有決定性作用。Hegde U等[13]應(yīng)用輕鏈與B和T細(xì)胞多種抗體系列的多色FCM來(lái)檢測(cè)其相應(yīng)抗原的新生物細(xì)胞，在CSF總淋巴細(xì)胞數(shù)僅占0.2%時(shí)仍可檢出。FCM極為敏感，能檢出異常的單克隆B細(xì)胞，而單克隆B細(xì)胞僅占淋巴細(xì)胞總數(shù)的0.01%。本組18份CSF標(biāo)本中，腦脊液FCM陽(yáng)性率為27.8%，而最終結(jié)合臨床特征發(fā)現(xiàn)確切的CNS受侵的樣本數(shù)為2例，而這兩例患者經(jīng)CSF-C檢查均未見(jiàn)異常，CSF-FCM證實(shí)為CNS侵犯的患者分別于診斷CNS受累后2~3月死亡，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-11]。本組CSF-FCM診斷陽(yáng)性率高于CSF-C檢查，可見(jiàn)CSF-FCM在檢測(cè)NHLCNS侵犯時(shí)診斷陽(yáng)性率比細(xì)胞學(xué)高，更容易發(fā)現(xiàn)CSF的病變，能對(duì)細(xì)胞學(xué)假陰性結(jié)果所致的遺漏給予補(bǔ)充。

本組病例中有1例確診B細(xì)胞來(lái)源的淋巴母細(xì)胞淋巴瘤患兒，經(jīng)CSF-FCM檢查證實(shí)CNS受侵，原幼細(xì)胞占獲取細(xì)胞的87.2%，主要表達(dá)CD2、CD5、CD3、CD4、CD8、CD38，提示為T(mén)細(xì)胞來(lái)源的淋巴母細(xì)胞淋巴瘤。因此，CSF-FCM檢查能提示NHL中樞受侵時(shí)B或T細(xì)胞來(lái)源，為臨床治療提供正確的指導(dǎo)。

結(jié)果顯示在檢測(cè)NHL侵犯CNS時(shí)，CSF-FCM檢查免疫表型優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)，與年齡<60歲、Ann Arbor Ⅲ-Ⅳ期、有B癥狀及LDH升高有關(guān)。因此在臨床工作中，對(duì)高度懷疑CNS侵犯，而CSF-C未發(fā)現(xiàn)確切證據(jù)的NHL病例，建議行CSF-FCM檢查，可能更容易獲取診斷依據(jù)。

參考文獻(xiàn)4

[1]Chamberlain MC，Glantz M，Groves MD，et al．Diagnostic tools for neoplastic meningitis：detecting disease，identifying patient risk，and determining benefit of treatment．Semin oncol， 2009(36)：35-45．

[2]Chamberlain MC，Johnston SK，Glantz MJ．Neoplastic meningitis：prognostic significance of the Karnofsky performance status．Arch Neural， 2009(66)：74-78．

[3]Chamberlain MC.Neoplastic meningitis.Neurologist， 2006(4)：179-187．

[4]關(guān)鴻志，王長(zhǎng)華，郭玉璞，等. 腦脊液細(xì)胞學(xué)的特異性發(fā)現(xiàn).中華神經(jīng)科雜志， 2004(37): 65-67.

[5]粟秀初，孔繁元.神經(jīng)系統(tǒng)臨床腦脊液細(xì)胞學(xué).北京：人民軍醫(yī)出版社， 2001：34-36.

[6]楊文鈺，竺曉凡.腦脊液流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)在急性淋巴細(xì)胞白血病兒童并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病中的診斷價(jià)值.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志， 2012(1)：38-42.

[7]Ismaili N, Bentama O,Errihani H.An unusual presentation of non-Hodgkin lymphoma.J Cancer Res Exp Oncol, 2010(1):15-18.

[8]Pui CH,Thiel E. Central nervous system disease in hematologic malignancies:Historical perspective and practical applications . Sem Oncol, 2009(4,Suppl 2):2-16.

[9]Herrlinger U，Glantz M，Schlegel U，et al.Should intra -cerebrospinal fluid prophylaxis be part of initial therapy for patients with non-Hodgkin lymphoma:What we know,and how we can find out more.Semin Oncol， 2009(4)：25-34.

[10]Boehme V，Zeynalova S，Kloess M，et al.Incidence and risk factors of central nervous system recurrence in aggressive lymphoma a survey of 1693 patients treated in protocols of the German high-grade Non-Hodgkin’s lymphoma study Group (DSHNHL) .Ann Oncol， 2007(18)：149-157.

[11]Bernstein SH ,Unger JM,LeBlanc M,et al.Natural history of CNS relapse in patients with aggressive non-Hodgkin’s lymphoma:a 20-year follow-up analysis of SWOG 8156-Southwest Oncology Group.J Clin Oncol, 2009(1):114-119.

[12]Renshaw AA, Hughes JH, Wang E, et al.Leukemia/lymphoma in cerebrospinal fluid:Distinguishing between cases that performed well and poorly in the College of American Pathologists Inter-laboratory Comparison Program in Non-gynecologic Cytology. Arch Pathol Lab Med, 2006(12):1762-1765.

[13]Hegde U，F(xiàn)ilie A，Little RF，el al．High ineidenee of occult leptomeningeal disease dettected by flow cytometry in newly diagnosed aggressive B-cell lymphomas at risk for central nervous system involvement：the role of flow cytometry versus cytology．Blood， 2005(105)：496-502．

(2014-12-13收稿，2015-01-25修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

The Values of CSF Flow Cytometry in Detecting CNS Involvement

in the Non-Hodgkin's Lymphomas

CHEN Mengxiang, HUANG Yunhong, HU Yunfei, SHEN Miaomiao, HUANG Depei

(DepartmentofOncology,GuizhouCancerHospital,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the value of diagnosis and prognosis with cerebrospinal fluid flow cytometry (CSF - FCM) in non-hodgkin's lymphoma (NHL) of the central nervous system (CNS) invaded. Methods: CSF-FCM and CSF cytology were employed to detect cerebrospinal fluid (CSF) of 18 NHL patients of initial treatment, positive rate of central nervous system (CNS) involvement detected by the two methods were compared, at the same time, the correlation among clinical factors such as patients' gender, age, clinical stage, B symptoms, lactate dehydrogenase (LDH), international prognostic index (IPI) score, PS score of physical state was observed. Results: The diagnostic positive rate of CSF-FCM in detecting NHL patients with CNS invaded was higher than that of CSF-C, the difference was statistically significant (P=0.045). Single factor analysis showed that immune phenotypes of NHL which CNS invaded detected by CSF-FCM was correlated to age, B symptoms and LDH (P=0.039, 0.001 and 0.009).Conclusions: CSF-FCM immune phenotypic detection is superior to the conventional cytology when CNS involvement in NHL.

[Key words]non-Hodgkin's lymphoma; central nervous system; cerebrospinal fluid; flow cytometry; cytology

[中圖分類(lèi)號(hào)]R733.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0283-05

通信作者**E-mail:pdhuangyh@sina.com

[基金項(xiàng)目]*貴州省科技廳社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合LG字(2012)063號(hào)]