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荔波少數(shù)民族人群HBV感染與ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)基因多態(tài)性研究*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0943.010.html

左婭**， 何燕***， 趙孝梅， 張婷， 王嬋娟， 禹文峰， 官志忠

(貴陽醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 了解貴州荔波少數(shù)民族人群雌激素受體(ESRα)基因PvuⅡ位點(diǎn)和T29C位點(diǎn)多態(tài)性與乙型肝炎病毒 (HBV)易感性的關(guān)系。方法： 選取貴州荔波縣少數(shù)民族健康對(duì)照91例和HBsAg攜帶者80例，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)方法測(cè)定受檢者基因組中ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)多態(tài)性，分析兩位點(diǎn)多態(tài)性與HBV易感性的關(guān)系。結(jié)果： 在荔波少數(shù)民族健康對(duì)照組和HBsAg攜帶組中均檢出ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)3種基因型，但3種基因頻率和等位基因頻率在兩組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： ESRα基因的PvuⅡ和T29C基因多態(tài)性與荔波少數(shù)民族人群中乙肝感染無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]少數(shù)民族； 基因，雌激素受體； 乙型肝炎； 攜帶者； 感染； 多態(tài)性； 貴州荔波

全球約有4億人為乙型肝炎病毒 (HBV)攜帶者，每年約有25萬人死于慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-3]。HBV感染的慢性化是一個(gè)多因素的結(jié)果，除與HBV的變異、宿主的年齡、性別和免疫狀態(tài)等有關(guān)外，機(jī)體遺傳基因的多態(tài)性可能也是導(dǎo)致HBV感染慢性化的另一個(gè)重要原因[4]。雌激素主要通過與雌激素受體α(estrogen receptora，ESRα)結(jié)合發(fā)揮作用[5-7]，而ESRα基因突變會(huì)導(dǎo)致雌激素功能的下降，引起HBV感染人群不同的遺傳易感性[8]，貴州是一個(gè)多民族省份，少數(shù)民族人口眾多，且大多聚居于較封閉偏遠(yuǎn)的山區(qū)，形成了遺傳學(xué)上相對(duì)隔離的人群。選用這樣相對(duì)封閉的隔離自然人群作為研究對(duì)象，可以最大限度的排除基因流(gene flow)現(xiàn)象對(duì)該人群等位基因頻率、基因型頻率的影響，對(duì)多基因疾病研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1對(duì)象與方法

1.1　研究對(duì)象

按照知情同意原則，隨機(jī)對(duì)貴州省荔波縣少數(shù)民族進(jìn)行問卷調(diào)查和抽樣分析，根據(jù)乙肝血清標(biāo)志物、肝功能指標(biāo)及HBV病毒DNA定量結(jié)果分別選取健康對(duì)照91例，男性45例，女性46例，(47.8±1.57)歲；HBsAg攜帶者80例，男性41例，女性39例，(48.5±1.42)歲。所選的研究對(duì)象3代內(nèi)無族外通婚史，彼此間無直接血緣關(guān)系 ，性別、年齡匹配 ，無乙型肝炎疫苗接種史。

1.2　全血DNA提取與定量

采用Qiagen公司的FlexiGene DNA提取試劑盒提取全血DNA；紫外吸收法測(cè)定DNA濃度，并標(biāo)化DNA模板濃度為100 mg/L。

1.3　ESRα基因PvuⅡ和T29C多態(tài)性位點(diǎn)基因擴(kuò)增

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)法，根據(jù)GenBank中ESRα基因PvuⅡ和T29C多態(tài)性位點(diǎn)的基因序列，設(shè)計(jì)PvuⅡ多態(tài)位點(diǎn)引物，上游系列為5′-TCTCCCACCTCAGCCTTAC-3′，下游系列為5′-ACCAATGCTC ATCCCAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長為448 bp。參照文獻(xiàn)[9] 設(shè)計(jì)T29C多態(tài)位點(diǎn)引物，上游系列為5′- GACCATGACCCTCCACACCAAAGGA TC-3′，下游系列為5′-ACCGTAGACCTGCGCGTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長218 bp。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)采用Touch-down PCR法： 94 ℃變性40 s、62 ℃退火50 s(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)、72 ℃延伸40 s，擴(kuò)增14個(gè)循環(huán)后改為94 ℃變性40 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸40 s繼續(xù)20個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4　PCR產(chǎn)物的酶切

ESRα基因PvuⅡ、T29C位點(diǎn) PCR產(chǎn)物分別以限制性核酸內(nèi)切酶PvuⅡ、MspⅠ酶切，37 ℃恒溫水浴過夜，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)確定對(duì)照組遺傳平衡狀況，根據(jù)PCR-RFLP結(jié)果確定樣本的基因型，用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率；SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件的χ2檢驗(yàn)分析各基因型在2組人群中的分布。

2結(jié)果

2.1　ESRα 基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)

PCR-RFLP結(jié)果顯示ESRα基因PvuⅡ位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為448 bp，每例樣本的目的條帶清晰，適于后續(xù)PCR產(chǎn)物的PvuⅡ酶切反應(yīng)。若ESRα基因PvuⅡ位點(diǎn)未發(fā)生突變，為野生型CC，不產(chǎn)生酶切位點(diǎn)(僅見448 bp片段)；若由野生型C突變成T，為突變型TT片段中產(chǎn)生酶切位點(diǎn)，酶切后觀察到380 bp、68 bp為突變型TT，觀察到448 bp、380 bp、68 bp 3個(gè)片段為雜合型CT；因 68 bp片段較小不易觀察，故不作為觀察項(xiàng)(見圖1)。ESRα基因T29C位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度218 bp，每例樣本的目的條帶清晰，適于后續(xù)PCR產(chǎn)物的MspⅠ酶切反應(yīng)。ESRα基因T29C位點(diǎn)若為野生型TT，無MspⅠ酶切位點(diǎn)(僅見218 bp)；若由野生型T突變成C，片段中產(chǎn)生MspⅠ酶切位點(diǎn)，酶切后可為突變型CC(觀察到192 bp、26 bp 2個(gè)片段)、或雜合型TC(觀察到218 bp、192 bp、26 bp 3個(gè)片段)；因 26 bp片段較小不易觀察，故不作為觀察項(xiàng)。見圖1。

注：ESRα基因T29C位點(diǎn)結(jié)果為 1、2、3、4，1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2-4為酶切產(chǎn)物，2為野生型TT，3為突變型CC，4為雜合型TC；ESRα基因 PvuⅡ位點(diǎn)結(jié)果為5、6、7、8，5為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6-8為酶切產(chǎn)物，6為野生型CC，7為突變型TT，8為雜合型CT圖1　ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Electrophoresis of PCR amplification products and enzyme digestion products of PvuⅡ and T29C loci of ESR gene

2.2　HBV感染與ESRα 基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率

ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在貴州少數(shù)民族健康對(duì)照組和HBsAg攜帶組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，表2。

表1　HBV感染與ESRα基因PvuⅡ多態(tài)性

表2　HBV感染與ESRα 基因T29C位點(diǎn)多態(tài)性

3討論

雌激素受體是存在于靶器官的細(xì)胞內(nèi)、可與激素發(fā)生特異性結(jié)合而形成激素-受體復(fù)合物、是使激素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的一種蛋白質(zhì)分子，至今發(fā)現(xiàn)的ESR有ESRα和ESRβ兩種亞型。人體中ESRα基因定位于第6號(hào)染色體短臂的第2區(qū)5號(hào)帶中的第1亞帶，由140 kb堿基構(gòu)成，編碼595個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子[10]。ESR不同的基因型有可能決定不同個(gè)體間 ESR的表達(dá)水平與功能差異，從而影響到病原體對(duì)宿主的易感性。1993年，駱抗先等[11]對(duì)中國7個(gè)民族的HBV感染調(diào)查發(fā)現(xiàn)HBsAg具有較高的陽性率，且這些民族間HBV感染存在差異。2006年，謝建萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ESRα基因PvuⅡ位點(diǎn)多態(tài)性與HBV感染后疾病進(jìn)展密切相關(guān)；2009年，郜玉峰等[13]的研究顯示ESRα基因PvuⅡ位點(diǎn)C/T基因型和C等位基因可能是乙型肝炎病毒感染慢性化的遺傳易感基因。也有大樣本研究發(fā)現(xiàn)，ESRα基因T29C位點(diǎn)基因多態(tài)性與HBV持續(xù)性感染相關(guān)[13]；對(duì)甘肅地區(qū)人群的ESRα基因T29C位點(diǎn)基因多態(tài)性與HBV感染轉(zhuǎn)歸的研究結(jié)果也顯示，ESRα基因T29C位點(diǎn)TT 基因型和T等位基因可能是HBV感染慢性化的遺傳易感基因[14]。但本次研究結(jié)果卻顯示ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布在貴州荔波少數(shù)民族HBV感染組和健康對(duì)照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與單可人等[15]對(duì)貴州彝族ESRα基因T29C基因型分布與 HBV 感染研究結(jié)果一致，提示不同民族和城鄉(xiāng)區(qū)域中ESRα基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)的分布存在差異，ESR基因PvuⅡ和T29C位點(diǎn)基因多態(tài)性在HBV感染的發(fā)生發(fā)展中起主要作用還是輔助作用，或是協(xié)同作用，又或是ESR基因多態(tài)性是否真正與HBV感染密切相關(guān)，尚有待于進(jìn)一步大樣本的研究證實(shí)。

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(2015-01-09收稿，2015-02-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

Study on Association ofESRαPvuⅡ and T29C Gene Polymorphism

with Susceptibility to Hepatitis B Virus Infection in Libo

Minority Population of Guizhou Province

ZUO Ya, HE Yan, ZHAO Xiaomei, ZHANG Ting,WANG Chanjuan, YU Wenfeng， GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: Analysis on the correlation of the polymorphism of estrogen receptor (ESRα) gene PvuⅡ and T29C loci with hepatitis B virus (HBV) infection in Libo minority population of Guizhou province. Methods: Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique was used to analyze the polymorphism of PvuⅡ and T29C loci in 91 healthy controls and 80 HBsAg carriers, the correlation of these two loci with susceptibility to HBV was analyzed. Results: Three genotypes of ESRα PvuⅡand T29C loci were detected in both control group and HBsAg group. Between two groups, the three kinds of gene frequency and allele frequency distribution showed no statistical difference (P>0.05). Conclusions: The PvuⅡ and T29C loci gene polymorphism of ESR is not associated with HBV susceptibility in Libo minority nationality.

[Key words]ethnic minorities； gene; estrogen receptor； hepatitis B; carries; infection； polymorphism; Guizhou,Libo

[中圖分類號(hào)]R394； R34-33； RZ273

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0222-03

通信作者***E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn

[基金項(xiàng)目]**貴陽醫(yī)學(xué)院2010級(jí)生物技術(shù)專業(yè)本科生